Biotecnología 1: Tarea 5 (entrega limite el miércoles 19 de marzo)
Por favor, observa los siguientes videos:
Ahora, escribe un breve ensayo (máximo 1 cuartilla), en el que resumas que se hizo para generar a la bacteria sintética. Si necesitas información extra puedes revisar los siguientes vínculos:
http://en.wikipedia.org/wiki/Mycoplasma_laboratorium
La noticia en la revista Science:
http://www.sciencemag.org/content/328/5981/958.full
El artículo de investigación en Science:
http://www.sciencemag.org/content/329/5987/52
Además de la cuartilla y con la información anterior sobre el experimento del grupo de Ventar, responde:
¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
¿Qué es un genoma mínimo?
Responder en esta plataforma, antes del martes 8 de octubre.
DNA (Photo credit: Rich Anderson)
13 comentarios
Aburto Cadena Leslie Araceli
Ensayo de la bacteria sintética
El proceso inició hace 15 años, realizaron varios métodos con varios organismos como virus y Mycoplasma genitalium que no funcionaron al principio. Hasta que probaron un experimento utilizando recombinación homóloga con el organismo Deinococcus radiodurans, el cual aguanta has 3 millones de rads de radiación.
Ellos hicieron explotar su cromosoma y después de un día lo dejaron como estaba antes, pensaron en realizar un transplante del cromosoma de una célula a otra, para esto activaron el cromosoma y le añadieron más genes para seleccionarlo, después le añadieron enzimas para digerirlo y matar sus proteínas, el cromosoma entró a la célula y fue reconocido como material extraño, la célula lo digirió y en ella sólo quedó el cromosoma nuevo que ellos habían diseñado.
Posteriormente, el cromosoma se tornó azul debido a los genes que tenía y las características de la especie original se perdieron en poco tiempo y se generó una nueva especie que estaba basada en el nuevo software que pusieron ellos, todas las características de la célula cambiaron, como su membrana y sus proteínas, Craig Venter asegura que el proceso está basado en la evolución.
Síntesis química de DNA
La síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácido nucleíco con una secuencia estructural química definida. La técnica es extremadamente útil en la práctica actual en laboratorios, porque provee un acceso rápido y barato a oligonucelótidos hechos a medida con una secuencia deseada. Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN en una dirección de 5′ a 3′, la síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo en el sentido opuesto, en la dirección 3′ a 5′. Actualmente, el proceso está implementado como una síntesis en fase sólida usando el método de la fosforoamidita y bloques de construcción de fosforoamidita derivados de 2’-deoxinucleósidos ( dA, dC, dG y T), ribonucleósidos (A, C, G y U), o nucleósidos químicamente modificados.
Para obtener el oligonucleótido deseado, se acoplan secuencialmente los bloques de construcción a la cadena de oligonucleótidos en el orden requerido por la secuencia del producto (ver Ciclo de Síntesis más abajo). El proceso ha sido automatizado completamente desde finales de la década de 1970. Al completarse el ensamblado de la cadena, se libera el producto de la fase sólida a la solución, luego se le desprotege, y finalmente se le recolecta. La existencia de reacciones secundarias establece límites prácticos a la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta aproximadamente 200 residuos de nucleótido) debido a que el número de errores se acumulan con la longitud del oligonucleótido sintetizado.
Los productos suelen ser aislados mediante HPLC para obtener los oligonucleótidos deseados en una alta pureza. Típicamente, los oligonucleótidos sintéticos son moléculas de DNA o RNA de una sola hebra de aproximadamente 15–25 bases de longitud. Comúnmente se les usa como oligonucleótidos de antisentido SiRNA, partidores para secuenciación de ADN y amplificación, sonda genética para detectar ADN o ARN complementario vía hibridación molecular, herramientas para la introducción dirigida de mutaciones y sitios de restricción , y para la síntesis artificial de genes.
Técnicas moleculares utilizadas para unir y ensamblar fragmentos de DNA
• Enzimas de restricción.
• Secuenciación.
• Hibridación de los ácidos nucleícos.
• Clonación del DNA.
• Ingeniería génica.
Gen de selección
Es un segmento de DNA que codifica para la expresión de una proteína cuya función o actividad permita identificar aquellas células donde nuestro vector se ha transfectado como pretendíamos. Hay proteínas como GFP que emite fluorescencia en la zona verde del espectro visible, de forma que cuando realizamos un ensayo de transfección aquellas células que emiten esta fluorescencia han incorporado el transgen de interés.
Genoma mínimo
Grupo más pequeño de genes que debe ser suficiente para mantener en funcionamiento una forma de vida en las condiciones más favorables imaginables en presencia de todos los nutrientes esenciales y en ausencia de estrés ambiental.
Maximiliano Padilla Romero.
Bacteria sintética.
En el año 2010 Craig Venter y su equipo lograron crear la primera célula bacteriana sintética. Mycoplasma genitalium fue el organismo escogido, ya que fue la especie con el menor número de genes es ese entonces y capaz de un crecimiento independiente en el laboratorio. Debido a que M. genitalium crece lentamente, un experimento puede tardar semanas en completarse. El equipo recurrió a dos especies de micoplasmas de crecimiento más rápido, M. mycoides como donante, y M. Capricolum subespecies como receptor.
El objetivo del experimento era trasplantar con éxito el DNA natural de una bacteria, en este caso Mycoplasma mycoides dentro de una célula Mycoplasma capricolum, creando una bacteria que se comportara como M. mycoides.
El equipo sintetizo una versión modificada del único cromosoma de Mycoplasma genitalium usando sustancias químicas. El cromosoma fue modificado para eliminar todos los genes cuyas pruebas en la bacteria viva habían demostrado ser innecesarios. El siguiente paso fue trasplantar el genoma mínimo sintetizado dentro de una célula bacteriana con su antiguo DNA extraído; la bacteria resultante fue llamada Mycoplasma laboratorium.
Primeramente, el cromosoma sintético fue construido a partir de mecanismos de levaduras. Esto se logró a través de una combinación de métodos enzimáticos in vitro y recombinación in vivo en Saccharomyces cerevisiae. Los pasos se pensaban muy sencillos: Montar el cromosoma en una levadura, después trasplantarlo una célula bacteriana receptora y así tendríamos nuestra nueva especie. Pero el equipo se enfrento a un problema, el cual era que los cromosomas bacterianos estrían creciendo en levadura, por lo que entonces, además de hacer el trasplante, se tenía que encontrar la manera de extraer el cromosoma bacteriano de la levadura eucariota dentro de una forma que permitiera transportarlo a una célula receptora. Sin embargo, los intentos iniciales para extraer el genoma de M. mycoides de la levadura y ser trasplantado en M. capricolum falló. Se descubrió que los micoplasmas donantes y receptores comparten un sistema de restricción común. Se supero esta barrera de restricción por metilación del DNA o simplemente por la interrupción en el sistema de restricción de la célula receptora. Finalmente, el experimento concluyo y los resultados arrojados fueron que la bacteria sintética era viable, es decir, capaz de replicarse miles de millones de veces.
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
La recombinación homóloga.
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser trasplantado?
Se purifica un cromosoma de una especie microbiana. Después se añaden unos genes extra para poder seleccionar este cromosoma.
Por los marcadores de agua sabemos que tenemos nuestro DNA sintetizado.
¿Qué es un genoma mínimo?
Genoma mínimo (Koonin, 2000): grupo más pequeño de genes que debe ser suficiente para mantener en funcionamiento una forma de vida en las condiciones más favorables imaginables.
En el caso de este experimento se procedió de manera que el cromosoma fue modificado para eliminar todos los genes cuyas pruebas en la bacteria viva habían demostrado ser innecesarios
En el Instituto Craig Venter crearon una bacteria con un genoma artificial. Los especialistas construyeron los genes de una bacteria a partir de fragmentos de genoma, al que introdujeron luego en otra especie de bacteria. La célula que recibió el genoma artificial comenzó a producir proteínas que estaban codificadas en éste, mientras que el genoma original fue eliminado.
De esta manera, los científicos crearon una célula que estaba controlada por un genoma foráneo, por lo que la denominaron «célula sintética», pese a que sólo el genoma es artificial.
Estas células se convertirán en un herramienta poderosa en el intento de hacer que la biología «haga lo que nosotros queremos», dijo Craig Venter, fundador del instituto que lleva su nombre, con sede en Rockville. «Tenemos una gran variedad de aplicaciones» en mente, añadió el genetista.
Los experimentos realizados son un paso más en el camino hacia el desarrollo de bacterias que produzcan biocombustibles o que sean capaces de absorber el dióxido de carbono, principal gas responsable del calentamiento global de la Tierra.
Estas bacterias artificiales también podrían ser útiles en el futuro en la producción de vacunas, indicaron Venter y sus colegas.
Sin embargo, los investigadores no lograron crear un organismo nuevo completo, ya que necesitaron para su trabajo al menos del genoma original de una bacteria y de la envoltura de una segunda bacteria. En primer lugar, los investigadores sintetizaron el genoma de la bacteria Mycoplasma mycoides en varias etapas.
Hasta ahora sólo es posible formar moléculas de genoma relativamente cortas. Por este motivo, los especialistas introdujeron los fragmentos cortos en células de levaduras, cuyas enzimas se encargaron de unirlas.
Las moléculas más grandes de ADN fueron introducidas en bacterias Escherichia coli y de nuevo en levaduras. De esta manera, se obtenían fragmentos más grandes aún.
Este procedimiento se repitió varias veces, hasta obtener el genoma completo formado por más de un millón de pares de bases.
Este genoma artificial, que fue denominado M. mycoides JCVIsyn1.0, fue introducido luego en la bacteria Mycoplasma capricolum.
Según Venter, el genoma artificial desplazó al genoma natural de la bacteria y asumió el control de las células. Para asegurarse de que el genoma artificial era el que se estaba expresando y no el natural, los expertos habían introducido en el ADN sintético ciertas marcas.
Un paso importante dijo Venter. «Seguro que cambió mi visión sobre la definición de la vida y más allá de eso, de cómo funciona la vida».
El subdirector del Centro de Regulación Genómica, Luis Serrano auguró que en un futuro «muy lejano» podría permitir diseñar organismos «a la carta».
Serrano ha recalcado que este trabajo «no es crear vida, ni es una célula artificial», sino que se trata de «algo más parecido a lo que pasa en la película Parque Jurásico: secuenciar el genoma del dinosaurio, sintetizarlo y meterlo en un huevo de reptil».
Los resultados hasta ahora son puramente a nivel de investigación básica, ha detallado este investigador, quien ha añadido que el trabajo permitirá «añadir y quitar genes del genoma de una de estas bacterias y por tanto analizar su función».
El problema, ha continuado, es que no es una técnica que ahora mismo «sea general y que se pueda utilizar con bacterias interesantes desde punto de vista aplicado».
¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
Los especialistas construyeron los genes de una bacteria a partir de fragmentos de genoma, al que introdujeron luego en otra especie de bacteria.
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
Introdujeron los fragmentos cortos en células de levaduras, cuyas enzimas se encargaron de unirlas.
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
• M. mycoides JCVIsyn1.0
Para asegurarse de que el genoma artificial era el que se estaba expresando y no el natural, habían introducido en el ADN sintético ciertas marcas.
¿Qué es un genoma mínimo?
Grupo más pequeño de genes que debe ser suficiente para mantener en funcionamiento una forma de vida en las condiciones más favorables imaginables
• en presencia de todos los nutrientes esenciales
• en ausencia de estrés ambiental
La creación de un organismo sintético a partir del diseño computacional y síntesis abiótica de la totalidad de su genóma sería un acontecimiento sin precedentes en la historia de la ciencia y podría representar el segundo pequeño paso para el hombre que llevará hacia un gran salto a la humanidad. Sin duda que Venter y sus asociados se han acercado a la síntesis de este organismo artificial explotando las herramientas de ingeniería genética al máximo.
Después de la secuenciación del genóma más pequeño perteneciente a la bacteria Mycoplasma genitalium con una longitud de 0.5 megabases aproximadamente (485 genes codificantes) este grupo de investigadores se preguntó si se podía sostener la vida con un genóma todavía más pequeño, extrayendo genes del genoma original, con lo cual se empezó la búsqueda del “genóma mínimo”. El genoma de Mycoplasma genitalium ya es suficientemente pequeño para incluso darse el lujo de carecer de pared celular, sin embargo esta falta de genes puede ser atribuida en buena medida a su hábito de parásito obligado. Aún así, el equipo de Venter descubrió que hay por lo menos 100 genes de los cuales se puede prescindir cuando son quitados individualmente.
Posteriormente se redoblaron los esfuerzos para crear un organismo sintético, con lo cual hubo un cambio de modelo experimental a Mycoplasma mycoides subespecie capri como donador y a Mycoplasma capricolum subespecie capricolum como receptor. Basándose en el genóma previamente secuenciado de Mycoplasma mycoides subespecie capri, en una computadora se diseñaron secuencias de oligonucleótidos sintéticos sobrelapados de 50-80 pares de bases de longitud, a partir de los cuales se sintetizaron secuencias de 1078-1080 pb. Estas secuencias se ensamblaron en conjuntos de 10 obteniendo 109 secuencias de 10Kb cada una. Estas se recombinaron para formar 11 secuencias de 100Kb y finalmente los 11 fragmentos se recombinaron para formar el genoma completo. La longitud final del genoma fue de 1,077,947 pb (más grande que el de Mycoplasma genitalium). Todos los ensamblajes se realizaron por recombinación homóloga in vivio en levadura.
El cromosoma fue clonado en la levadura y extraído para insertarse en la bacteria receptora. Para llevar a cabo este procedimiento se tuvo que metilar el cromosoma sintético para protegerlo de la digestión de enzimas de restricción que digirieron el cromosoma original. Con esto consiguieron que el material genético introducido tomara control de la célula y pudiese ser replicado para generar nuevas células hijas de la célula sintética.
Para verificar que el transplante se había dado con éxito se agregaron marcadores de selección como resistencia a tetraciclina y creciemiento de colonias azules. El cromosoma sintetizado incluyó además “marcas de agua”, que pueden ser leídas a través del código genético, usando las letras designadas para los aminoácidos como herramienta para escribir los nombres de los autores.
Los críticos señalan que no se creó un nuevo organismo, pues el citoplasma y la membrana de la célula receptora no fueron químicamente sintetizados, y parece ser más bien que el mérito del experimento fue cambiar un genoma por otro, lo cual no es poca cosa. Este experimento nos habla sobre lo versátil que es la vida y puede significar un gran acercamiento hacia un mejor entendimiento de los seres vivos. Incluso creo que es posible formular recetas para sintetizar células similares a los primeros seres vivos, utilizando el mismo principio del genóma mínimo, ensamblando solo los genes necesarios para crear un organismo heterótrofo con metabolismo fermentativo, que sea capaz de mantener su estructura celular y de autorreplicarse a partir de un mundo de RNA.
¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
Uno de los métodos más utilizados para la síntesis química de oligodesoxirribonucleotidos es un procesos de cuatro pasos de fosforamidita. Los desoxirribonucleosidos permanecen unidos a un soporte de vidrio poroso. En el primer paso un grupo 5`-O-dimethoxitrilo (DMT) es removido del desoxirribnoucleosido por ácido tricloroacético (TCA) con lo que se “desprotege” el carbono 5`. En el paso dos sucede una reacción de condensación con la formación de un enlace internucleotídico fosfato triester con lo que empieza la elongación del oligodesoxirribunocleótido. En el paso tres se da un proceso de “capping” para esterificar errores en las secuencias. El enlace internucleotidico es oxidado para formar un enlace fosfotriester. El proceso se repite de manera cíclica hasta obtener el oligodesoxirribonucleotido de la longitud deseada, que es liberado de la superficie de soporte con hidróxido de amonio (Herdewijn, 2005).
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
Recombinación homóloga.
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
por la expresión de los genes de resistencia a tetraciclina y de crecimeinto de colonias azules
¿Qué es un genoma mínimo?
la menor cantidad de instrucciones (genes) requeridas para sostener la vida de un organismo.
Referencia:
-Herdewijn, P. (2005). Oligonucleotide synthesis: methods and applications. Humana Press.
Ensayo.
La creación de una «célula sintética» fue el paso primordial en el surgimiento de la biología sintética. Craig Venter publica en 2010 “Creation of a bacterial cell controlled by a
chemically synthesized genome”, combinando la ingeniería con la genética.
Todo esto inció con la secuenciación de el genoma bacteriano de Mycoplasma genitalium que es el genoma más pequeño existente formado por 517 genes.
Se prosiguió con la determinación de los genes no esenciales y de los genes mínimos indispensables para que la bacteria se pudiera duplicar, esto se logró por mutagénesis global de transposones (extracción de un transposon para ser insertado en un cromosoma hospedero). Los resultados arrojaron que eran 350 los genes esenciales para el crecimiento en laboratorio.
Posteriormente en 2007 realizaron un «transplante» de cromosomas de una especie de bacteria a otra; usaron los cromosomas ‘naturales’ de Mycoplasma mycoides a Mycoplasma capricolum, las células resultantes fueron fenotípicamente idénticas a la cepa de M. mycoides, esto fuer como un paso previo para la fabricación de la célula sintética puesto que se requiere de la introducción del genoma sintético a un citoplasma receptivo. Esto se publicó en el trabajo “Genome Transplantation in Bacteria: Changing One Species to Another”.
Después continuaron con la creación de de un cromosoma artificial que coincidia con M. genitalium con 582.970 pares de bases; contenía todos los genes silvestres excepto el MG408 que fue interrumpido para bloquear su patogenicidad además aplicaron «marcas de agua» esto para tolerar la inserción de transposones.
Como M. genitalium tiene una tasa muy lenta de crecimiento decidieron cambiar a M. mycoides y secuenciaron su genoma. Los cromosomas de M. mycoides fueron clonados en levadura y luego fueron transferidos al receptor M. capricolum modificando su genoma.
Creación de Mycoplasma laboratorium.
Preguntas.
¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
El montaje se realizó en 3 pasos a partir de casetes de ADN de 1,078 pb. Casetes de 1,080 pb producidos a partir de superposición de oligonucleótidos sintéticos, se recombinaron en series de 10 para producir 109 ensambles (~10kb) que posteriormente se recombinaron en series de 10 para obtener 11 ensambles de ~100kb.
En la etapa final del ensamble los 11 fragmentos fueron recombinados en el genoma completo, el ensamblaje se llevó a cabo en vivo por recombinación homóloga en levadura. Variaciones en el genoma natural incluyen marcas de agua (WM1-WM4) y 20 regiones con polimorfismos de nucleótidos para monitorear el ensamblaje. Las coordenadas del genoma están en relación con el primer nucleótido de la secuencia natural de M. mycoides, los casetes 1 y 800-810 eran innecesarios y se retiraron del ensamblaje, el casete 2 fue superpuestos con el 1104 y el casete 799 superpuesto con el 811
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
Para ‘cortar’ en los sitios necesarios se usan enzimas de restricción, para unir los fragmenos más pequeños se usan ligasas 10kpb, para fragmentos de mayores 100kpb múltiplex PCR y para ensamble final por recombinación homóloga.
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
Mediante mutagénesis global de transposones, determinaron que genes no eran esenciales y los genes mínimos indispensables para que se duplicara la bacteria. Al analizar la secuencia mostró que había 480 genes codificantes para proteínas, de los cuales 350 genes son esenciales en condiciones de crecimiento en el laboratorio. También se incluyeron 100 genes con función desconocida, sin embargo, no se sabe cuál de estos cien genes son a la vez prescindible quizá por que la función celular no está descrita.
Para saber que sí se transplantó se usaron las enzimas de restricción Asc I y BssH II para cortar el ADN aislado, el nuevo cromosoma reconoció al cromosona original como extraño, este mostró un color azul, las membranas de la célula eran las correspondientes al cromosona transplantado al igual que las proteínas y el código genético era el mismo al transplantado.
¿Qué es un genoma mínimo?
Un genoma compuesto por el mínimo número de genes con el que un organismo puede vivir.
El equipo de Venter no creó vida artificial, sólo un genoma artificial. Yo no creo que la definicion reduccionista de Dawkins aplique, pues no sólo la vida depende del material genético; lo cual queda comprobado por el mismo experimento en cuestión, ya que tuvieron que usar una célula natural para poder «correr» su DNA diseñado por computadora. Creo que es un esfuerzo interesante de investigación, pero creo que más de 10 años y 40 millones de dólares pueden ser mejor invertidos en esfuerzos de conservación ambiental, implementación de tecnologías limpias y campañas extensas de concienciación sobre el cuidado de los servicios ecosistémicos. Creo que sí abre un nuevo paradigma, pues ahora se puede intentar jugar a la evolución desde cero, lo cual puede traer grandes beneficios y enormes males. Algo que me desagrada es el excesivo uso de medios de comunicación para dar a conocer sus hallazgos, algo que me parece más una parafernalia innecesaria si tú investigación es de tal trascendencia. Si así lo fuese, no nLoesitaría de tanta mercadotecnia detrás. Y por último, el hecho de escuchar sobre la futura inversión multimillonaria de Exxon para desarrollar algas mejoradas que fijen más CO2 y con ellas producir biocombustibles me parece una solución bastante elaborada, cuyo objetivo de disminuir las emisiones de GEIs puede ser lograda de igual manera y a menor costo invirtiendo en alternativas para los combustibles fósiles (o que tengan que usarse con un motor de combustión interna. Lo que se necesita cambiar es nuestra relación con el planeta, no a los seres en que en él habitan.
La síntesis de DNA artificial se hace usando precursores de las 4 bases en frascos separados, y uniendo las bases en segmentos cortos, para luego unirlos con sitios de apareamiento específicos, y luego multiplicar la cantidad usando PCR.
El DNA era reconocido gracias a las «marcas de agua». Crearon una clave en aminoácidos para poner sus nombres como investigadores.
El genoma mínimo es el más pequeño conjunto de genes que posibilitan la vida de una célula autorreplicante de vida libre
El primer genoma sintetico
El cientifico J. Craig Venter consiguió crear un genoma sintético, creado por síntesis química, que se replica a partir de una una célula bacteriana. Han sustituido el genoma de la bacteria Mycoplasma capricolum por otro sintético con la secuencia del de la especie Mycoplasma mycoides, que ha empezado a actuar y auto-replicarse como la segunda.
Este genoma ensamblado con fragmentos de ADN sintetizados químicamente, a partir de la bacteria ‘Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0’, la primera célula controlada por un genoma sintético. Al principio únicamente consiguieron sintetizar y copiar químicamente un genoma bacteriano, y habían logrado trasplantar el genoma de una bacteria a otra. Para llegar a crear un método en el que en el que: primero sinteticen el genoma del microorganismo Mycoplasma mycoides y después trasplantarlo a Mycoplasma capricolum, al que se le extrae el suyo.
Este nuevo genoma logró activar la célula receptora para que produjera proteínas y se auto-replicara como M. mycoides. Surgió así Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0, que no se puede considerar una nueva especie o subespecie porque es muy similar a la natural”. El genoma sintético es una copia del original solo cambia en 14 genes. En el que se formaron casetes de 1.080 pb con 80 pb producidos por un conjunto de oligonucleótidos sintetizados químicamente y corregidos para que coincidieran.
“Esto se convierte en una herramienta muy poderosa para tratar de diseñar lo que queremos hacer en la biología. Disponemos de una amplia gama de aplicaciones en mente”
¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
R: Por medio de las enzimas de restricción se cortan los fragmentos del DNA de interés y posteriormente se unen, aunque no mencionan como lo vuelven a unir, podríamos inferir que estas regiones de DNA se unen entre sí de manera natural o también puede ser por medio de una primasa, posteriormente todos estos fragmentos de DNA (oligonucleótidos), los someten a una PCR y así producen un nuevo cromosoma formado a partir de fragmentos pequeños.
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
R: Por medio de un mecanismo denominado sobrelapamiento homologo y posteriormente recombinación homóloga in vitro, utilizando un organismo procarionte Deinococcus radiodurans se lleva a cabo la unión de estos fragmento de DNA, formando o sintetizando nuevo DNA y posteriormente el nuevo DNA se transforma dentro de células de bacterias (en este caso Escherichia coli) y finalmente se trasplanto a una célula de levadura para hacerla crecer más rápidamente.
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser trasplantado?
R: El gen resistente hacia la Tetraciclina y el gen para el operon Lac Z
Ellos incluyen dentro de los cromosomas un fluoroforo o marcador dentro de los genes del genoma trasplantado, que emite luz azul al ser colocados a una determinada longitud de onda especifica. Además colocaron una nucleasa (probablemente) específica para que degradara el DNA de la vieja célula y no el de la nueva célula.
¿Qué es un genoma mínimo?
R: Se refiere a todas aquellas regiones de nucleótidos dentro del DNA que tienen una función específica (conocida) o que llevan a cabo funciones vitales para el organismo, pero no se encuentran incluidas aquellas que se desconoce su función o no codifican para funciones vitales y por lo tanto son eliminadas.
La biotecnología se ha desarrollado de manera impresionante durante los últimos años, ya que en muy poco tiempo “relativamente”, se han logrado avances extremadamente grandes. Como se observa en los videos, el hecho de haber logrado crear una célula totalmente sintética, es el resultado de años de trabajo e investigación. Para poder crear ésta célula, primero fue necesario poder secuenciar el DNA completo del organismo en cuestión, y obtener su genoma mínimo. Una vez obtenido éste genoma mínimo, se comenzó la síntesis del DNA, así como el ligamiento y transplante del nuevo genoma. Para poder distinguir las células que contenían el DNA creado, se les añadió al genoma 4 marcas de agua, las cuales están incluidas dentro de la secuencia y codifican para proteínas. Es importante mencionar, que para poder realizar este proceso, fue necesario depurar toda la síntesis, ya que no podía presentar errores la secuencia, pues de otra forma no funcionaria (hay secciones de suma importancia y vitalidad en la secuencia, que no pueden tolerar errores). La célula sintética, es capaz de autorreplicarse, y esto prueba la efectividad de la célula, pues es capaz d sobrevivir y replicarse con el genoma mínimo que le fue creado biotecnológicamente. Esto es solo el primer paso que se da hacia un mejor desarrollo de generación de organismos sintéticos, para lograr la mejora de la calidad de vida, ya que en un futuro tal vez se podrían utilizar este tipo de tecnologías para generar células específicas, tejidos e incluso órganos completos que ayuden en la mejora de la medicina.
1.- ¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química de DNA? Por medio de la síntesis de oligonucleótidos, logrado gracias a la realización de varias rondas sucesivas de deprotección y aparemiento de nucleótidos fosforamidita protegidos, haciendo las secuencias más cortas y provocando que las secuencias mayores a 1kb de largo fueran inviables. Para secuencias grandes, es necesario el ligamiento de DNA. Estrategia para la creación del genoma sintético:
• Síntesis: 1kbp. La secuencia fue sintetizada con Blue Heron en 1078 1080bp cassettes con un sobrelape de 80pb y sitios de restricción NotI
• Ligamiento: 10kpb. Grupos de una serie consecutiva de 10 cassettes fueron ligados y clonados en E. Coli en un plásmido.
• PCR multiplex: 100kpb: grupos de una serie de 10 consecutivos ensamblajes de 10kpb fueron unidos usando un PCR multiplex y utilizando un par de primer por cada 10kpb ensamblajes.
• Aislamiento y recombinación.
2.- ¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA? Ensamblaje en 3 pasos
• cassettes de 1080pb fueron recombinados para producir oligonucleótidos sintéticos sobrelapados.
• recombinados en sets de 10 para generar ensamblajes de 109- 10kb. Fueron recombinados nuevamente para producir ensamblajes de 11-100kb
• Recombinación de los 11 fragmentos en un genoma completo.
3.- ¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
El gen de selección utilizados fue el dnaA. Para poder distinguir las células con el DNA transplantado se implementó el uso de 4 diferentes marcas de agua, que se encuentran dentro del código genético y codifican para proteínas específicas. Además morfológicamente de forma macroscópica, las células modificadas presentan un color azul, a diferencia de las células silvestres, que son transparentes.
4.- ¿Qué es un genoma mínimo? • Genoma mínimo: es aquel genoma, que tiene un número reducido de genes (aproximadamente de 382 genes en el caso de Mycoplasma genitalium), y solo cuenta con aquellos genes mínimos necesarios para mantener la vida.
El proyecto de la bacteria con cromosoma sintético tardó 15 años en realizarse. Fue un trabajo pionero en mas de una cuestión. El primer reto fue formar grandes cantidades de DNA sintético y lograr así tener un cromosoma sintético. Dichos avances van de la mano con el desarrollo de la bioinformática. Después de hacer este cromosoma en computadora, se intentó transportar de una levadura a una bacteria. Para lograr esto, el DNA tuvo que metilarse, Asi se evitó la degradación por DNAasas. Después de localizar errores en genes letales, la bacteria aceptora del DNA logro reproducirse. Para garantizar que el cromosoma es sintético se le puso una marca de agua en el código genético.
¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
Sobrelapando oligonucleótidos para formar cassetes genómicos y posteriormente cromosomas.
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
La recombinación de los cassetes.
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
Se escogen los genes necesarios para la subsistencia y reproducción de la bacteria. El DNA tiene una marca de agua para garantizar que es sintético. Tiene los nombres de 44 investigadores, tres frases y una pagina web.
¿Qué es un genoma mínimo?
Es el numero de genes necesarios para la subsistencia y reproducción en laboratorio del individuo
CREACIÓN DE UNA BACTERIA POR UN GENOMA SINTETIZADO QUÍMICAMENTE.
EL equipo de científicos de J. Craig Venter reportaron el diseño, la síntesis, y el ensamble de el genoma de 1.08 –pares demegabases de Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 empezando de la información digital de la secuencia del genoma y su transplante dentro de M. capricolum para crear una nueva M. mycoides que es controlada sólo por el cromosoma sintético. El único DNA en las células es la secuencia de DNA sintética diseñada, así, las nuevas células esperan propiedades fenotípicas y son capaces de auto-replicación continua.
Varios obstáculos resultaron en el transplante y expresión de un cromosoma sintetizado químicamente en una célula recipiente bacteriana para establecer una célula controlada por un genoma sintético. Debido a que M. genitalium tiene una taza de crecimiento extremadamente lenta , los científicos se fijaron en dos especies de de mycoplasma de crecimiento rápido, M. mycoides subespecie capri (GM12) como donador, y M. capricolum subespecie capricolum (CK) como recipiente.
Por lo tanto, se buscó la forma de clonar el cromosoma bacteriano a un plásmido en una levadura. Sin embargo, posteriormente combinaron todos sus procedimientos previamente establecidos y reportaron la síntesis, ensamblaje, clonación, y el éxito del trasplante de la 1,08-MBP M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma, para crear una nueva célula controlada por este nuevo genoma sintético.
Diseño del genoma sintético. El diseño del genoma de M. mycoides JCVI-syn1.0 fue basado en el alto grado de las secuencias del genoma de dos cepas de laboratorio de M. mycoides subespecie capri GM12. Una fue la de el genoma donador [GenBank accession CP001621]. La otra fue una cepa creada por transplante de un genoma que ha sido clonado en una levadura YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres [GenBank accession CP001668]. Éste proyecto fue dependiente en el grado de éstas secuencias. Se diseñaron genomas sintéticos y la mayoría de las secuencias diseñadas y sintetizadas se basaron en la secuencia de CP001621. Después escogieron la secuencia del genoma exitosamente transplantado de la levadura (CP001668) como el diseño de referencia.
ESTRATEGIA DE ENSAMBLE DEL GENOMA SINTÉTICO DE M. mycoides EN LEVADURA. En el proceso de construcción, las cintas de ADN y el ensamble fueron diseñados para contener sitios de restricción Not I en sus extremos y recombinación en presencia de elementos del vector para permitir el crecimiento y la selección en la levadura.
TRANSPLANTE DEL GENOMA COMPLETO. El genoma sintético intacto de M. mycoides del clon de la levadura sMmYCp235 fue transplantado en los sitios de restricción de las células receptoras de M. capricolum.
TRANSPLANTE Y ENSAMBLE DEL GENOMA SINTÉTICO.- Los transplantes que contienen un genoma sintético fueron seleccionados por PCR multiple con un conjunto de primers que producen cuatro amplicones. Posteriormente encontraron que hubo un reemplazamiento completo del genoma de M. capricolum por el genoma sintético durante el proceso de transplante (en las bacterias).
Las células con sólo el genoma sintético mostraron ser auto- replicantes y con capacidad de crecimiento logarítmico de las colonias en las placas con agar.
** La demostración de que nuestro genoma sintético da lugar a trasplantes con las características de las células de M. mycoides implica que la secuencia de ADN en la que se basa es lo suficientemente precisa para especificar una célula viva con las propiedades adecuadas.
1.- ¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
A partir de la información de la secuencia del genoma digital. Se produjeron moléculas ó cintas de DNA sintetizado químicamente de aproximadamente 6 Kb de tamaño. Combinado con métodos enzimáticos y recombinación in vivo en Saccharomyces cerevisiae. El genoma sintético completo fue creciendo establemente como un plásmido centromérico de levadura (YCp). El diseño del genoma de M. mycoides JCVI-syn1.0 fue basado en el alto grado de las secuencias del genoma de dos cepas de laboratorio de M. mycoides subespecies capri GM12. Una fue la de el genoma donador [GenBank accession CP001621]. La otra fue una cepa creada por transplante de un genoma que ha sido clonado en una levadura YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres [GenBank accession CP001668]. Éste proyecto fue dependiente en el grado de éstas secuencias. Se diseñaron genomas sintéticos y la mayoría de las secuencias diseñadas y sintetizadas se basaron en la secuencia de CP001621. Después escogieron la secuencia del genoma exitosamente transplantado de levadura (CP001668) como el diseño de referencia.
2.- ¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
Las cintas diseñadas de DNA se produjeron con oligonucleótidos sintetizados químicamente, dichas moléculas contenían sitios de restricción NOT 1 en sus extremos para la recombinación con elementos de la levadura y originar ensambles cada vez más grandes hasta su recombinación dentro del genoma completo. Dicho genoma también contiene sitios de restricción (BSS H II) donde se implanta el genoma sintético.
Los clones de levadura conteniendo un genoma sintético ensamblado completamente fueron analizados por PCR multiple con un conjunto de primer´s que producen 11 amplicones; uno en cada una de las 11 uniones de ensamble.
3.- ¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
Los genes lacZ que expresa β- galactosidasa, y dnaA para la replicación cromosomal.
Seguido al transplante y a la replicación del genoma sintético para formar una colonia, la progenie no contendrá alguna proteína que estuviera presente en la célula recipiente ó receptora original.
4.- ¿Qué es un genoma mínimo?
Es el conjunto mínimo de genes con los que un organismo puede sobrevivir llevando a cabo sus funciones vitales.
Vida sintética
La especie humana se ha preguntado los porqués de la vida, desde el inicio de los tiempos, llegando a proponer miles de formas (desde las teológicas hasta las más avanzadas en el ámbito científico) en el origen de esta, pero siempre (o al menos hasta hace unos pocos años) conservando un “respeto” en cuanto a intentar crear esta.
Pero en los años recientes, y debido a la creciente población y aumento en las necesidades básicas que esto mismo conlleva, la ciencia se ha visto en la necesidad de llevar esta curiosidad por la vida un paso más allá, se ha logrado crear vida sintética, algo que hasta hace unos años parecía realmente imposible, se comenzó primero con técnicas como el PCR en el que se replican fragmentos ya preexistentes de DNA, después creando sintéticamente unos pequeños fragmentos de DNA, para después poder avanzar hacia unos fragmentos más grandes, cromosomas y finalmente poder crear genomas completos en el laboratorio pero… ¿Cómo se logró crear el primer organismo de laboratorio?
Mycoplasma laboratorium es el primer organismo vivo creado en un laboratorio, es derivado del genoma de Mycoplasma genitalium y M.mycoides que fueron elegido por tener uno de los genomas más pequeños conocidos hasta ahora (475 genes), el genoma sintético está creado tomando como base los genes esenciales para la supervivencia de M.genitalium pero fue reducido a 382 genes y se le agregaron algunas marcas para poder diferenciarlo. El equipo de Venter comenzó primero comprando más de 1000 secuencias que comprendían todo el genoma de M.mycoides, y para poder reconocerlo como sintético codificaron secuencias dentro del DNA que formaban mensajes especiales, como emails o nombres de personas relacionadas con el proyecto; Posteriormente unieron 10,000 secuencias, después 100,000 y así con todo el genoma, después este le fue insertado a una levadura para ser modificado, posteriormente a una célula de M.capricolum le fue retirado su genoma y le fue insertado el genoma sintético. Finalmente, y después de corregir algunos errores que retrasaron el proyecto, fueron encontradas las colonias azules que indicarían a la bacteria sintética, el equipo de Venter (que también participó en el proyecto privado del genoma humano) lo había logrado, transformaron una especie en otra…habían logrado tranformar una célula en otra a partir de un genoma sintético, lejos estaban los tiempos en los que el simple hecho de codificar un genoma llevaba años.
Debemos observar lo asombroso de este logro, y el potencial que una real forma de vida completamente sintética tiene para el ser humano, solo nos queda enfocar más potencial y capital para la ciencia y la investigación en este campo, pero el futuro luce más sintéticamente prometedor que nunca.
¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
R=Se realiza mediante la síntesis de olgonucleótidos, que se lleva a cabo en dirección 3’-5’, es una adición sistemática de residuos de nucleótidos al extremo 5’ de la cadena creciente hasta lograr la secuencia deseada.
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
R=La reacción se realiza en soluciones especiales que catalizan la unión de los nucleótidos.
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
R=Son genes que ellos insertaron y están acomodados en un orden especial que literalmente hablando forman algún mensaje especial. Se puede secuenciar el genoma del nuevo organismo y buscar estos genes insertados especialmente, pero también si el nuevo organismo codifica las proteínas especiales del genoma de la primera especie, proteínas que no estarían en el organismo “huésped” del genoma.
¿Qué es un genoma mínimo?
R=Un genoma mínimo es un genoma al que se le han retirado todos los genes no esenciales para la supervivencia del organismo portador de ese genoma. En otras palabras solo lo compondrían todos los genes necesarios para las funciones básicas del organismo.
Destacados científicos, entre ellos Craig Venter, Hamilton Smith y Clyde Hutchinson III, crearon la primera célula a partir de un código digital en el ordenador, es decir, crearon vida sintética.
Básicamente la metodología de este proyecto implicó, de primera instancia, la creación de un cromosoma que se tuvo que montar en una levadura. Dicho cromosoma fue trasplantado a una célula receptora y esta última se convirtió en una nueva especie bacteriana nombrada “Mycoplasma laboratorium”.
En el año 2003, los científicos lograron sintetizar el genoma del bacteriófago Phi-X174 con aproximadamente 5000 pares de bases, de manera que se pensó hacer piezas de este tamaño para ensamblarlas en sólo cromosoma, sin embargo, se tenían dos dificultades principales: se tenía que resolver la química para la fabricación de moléculas grandes de DNA y se necesitaba un mecanismo para separar y activar el cromosoma en una célula receptora.
El avance en este proyecto se dio cuando lograron que fuera una levadura la encargada del ensamblaje, no obstante, surgió otra dificultad que involucraba la activación del cromosoma. Dicho problema se resolvió más adelante eliminando genes de los sistemas de restricción y metilando el DNA, dado que se dieron cuenta de que era la metilación la que protegía al DNA de las enzimas de restricción.
Fue para el año 2010 cuando se informó la síntesis del genoma de “Mycoplasma mycoides” con más de un millón de pares de bases, el cual se trasplantó a una célula receptora de “Mycoplasma capricolum”. El nuevo genoma tomó el control de la célula y el nuevo organismo se multiplicó. Al final se usaron marcas de agua para que quedara absolutamente claro que el ADN era sintético .
En base a estos resultados, se espera desarrollar proyectos biotecnólogicos que contrarresten los problemas de consumo que enfrentamos en la actualidad dada la sobrepoblación. Entre algunas de las ideas a estos proyectos se encuentra la de sintetizar bacterias capaces de fabricar el hidrógeno y los biocarburantes, así como la de absorber el dióxido de carbono y otros gases de efecto invernadero para re-utilizarlos y por supuesto, en el área biomédica, la creación de vacunas.
CUESTIONARIO:
¿Cómo se lleva a cabo la síntesis química del DNA?
Mediante un ciclo de reacciones que se repiten hasta que se alcanza la longitud deseada:
1.Desprotección: Consiste en eliminar mediante un tratamiento ligeramente ácido, al grupo Dimetoxitritilo (DMT). Este grupo protege al Hidroxilo 5′ terminal de la base (nucleótido) correspondiente.
2. Acoplamiento: Una vez libre el grupo hidroxilo, se adiciona el siguiente nucleótido, en forma de ß-cianoetilfosforamidito, correspondiente a la sequencia deseada.
3.Bloqueo (capping): Concluído el paso de acoplamiento, se bloquean todos los hidroxilos que no reaccionaron (menor al 2% del total) con la nueva base, esto mediante una reacción de acetilación.
4.Oxidación: Finalmente, el grupo fosfito internucleotídico se oxida a un grupo fosfato estable.
¿Qué mecanismos moleculares están utilizando para unir y ensamblar los fragmentos de DNA?
Enzimas de restricción (enzimas de reconocimiento y corte específico, o endonucleasas).
¿Cuáles son los genes de selección? ¿Cómo están seguros que el DNA pudo ser transplantado?
Los genes de selección son aquellos que muestran buena evidencia de estar diferencialmente expresados. En experimentos de clonación génica, X-gal es usado como indicador de aquellas células que expresan la enzima β-galactosidasa, codificada en el gen lacZ del operón lac. De esta manera se puede estar seguro de que el ADN fue trasplantado puesto que las bacterias que no han sido transformadas pueden romper el X-gal presente en el agar del medio, tornándose sus colonias de color azul y las bacterias que han sido transformadas, no pueden procesar X-gal y permanecen con su coloración blanca natural.
¿Qué es un genoma mínimo?
Es la estimación e identificación del número mínimo de genes suficientes para construir o mantener un organismo con organización celular.
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