Biotecnología 1: Tarea 6
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Biotecnología 1: Tarea 6
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10 comentarios
La estrategia de clonación 1 utiliza la(s) enzima(s) de restricción BamH1 para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restriccción BamH1 para cortar el gen W.
La estrategia de clonación 2 utiliza la(s) enzima(s) de restricción Kpa1 para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restriccción Kpa1 para cortar el gen W.
La estrategia de clonación 3 utiliza la(s) enzima(s) de restricción EcoR1 y Sal1 para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restriccción EcoR1 y Xho1 para cortar el gen W.
¿En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección? la tercera.
a) Diga tres características que un plásmido debe de contener para permitir la clonación y amplificación del gen A en las células bacterianas.
1. Debe tener sitios de restricción
2. Sitio de origen de la replicación
3. Genes de selección
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo en el plásmido?
Kpn1 para incluir el gen completo con su promotor.
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A ? Explica brevemente.
Kpn1 para que los extremos libres del gen A puedan aparearse con los extremos del plásmido.
Posteriormente, cultivarás estas células bacterianas transformadas en un medio que te permita distinguir entre las bacterias que contengan el plásmido de las que no. En que tipo de medio de cultivo crecerías a tus bacterias transformadas. Explica tu respuesta.
En un medio con ampicilina. Al digerir el plásmido con Kpm1 e insertar el gen A se pierde la resistencia a tetraciclina, por lo tanto las bacterias clonadas solo crecerán en ausencia de tetraciclina pero también podrán proliferar con ampicilina debido a que el gen de resistencia a ampicilina permanece. Este medio además asegura que no crescan colonias sin resistencia alguna.
1.
La estrategia de clonación 1 utiliza la(s) enzima(s) de restricción -EcoRI y Kpn I- para cortar el vector y la(s)
enzima(s) de restriccción- EcoRI y KpnI- para cortar el gen W.
La estrategia de clonación 2 utiliza la enzima de restricción – KpnI- para cortar el vector y la
enzima de restriccción -KpnI- para cortar el gen W.
La estrategia de clonación 3 utiliza la(s) enzima(s) de restricción -EcoRI y SalI- para cortar el vector y la(s)
enzima(s) de restriccción -EcoRI y XhoI- para cortar el gen W.
¿En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección?
R: en la estrategia 1 y en la 3.
2.
a) Diga tres características que un plásmido debe de contener para permitir la clonación y amplificación del gen A en las células bacterianas.
R: El sitio Ori (para la replicación), los sitios de restricción adecuados y el gen de resistencia a antibiótico.
b) ¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo
en el plásmido?
R: Primero cortaría con XhoI y después con KpnI.
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A ? Explica brevemente.
R: XhoI y KpnI; Si se corta con XhoI le estaría quitando más o menos 1 kb al plásmido entonces al agregarle el gen A el plásmido resultante quedaría de un tamaño adecuado (no tan grande). Aunque KpnI corta el gen de resistencia a tetraciclina, aún le queda el gen de resistencia a Ampicilina.
Posteriormente, cultivarás estas células bacterianas transformadas en un medio que te permita distinguir entre las bacterias que contengan el plásmido de las que no. En que tipo de medio de cultivo crecerías a tus bacterias transformadas. Explica tu respuesta.
R: Primero para distinguir a mis bacterias ya transformadas de otras que no, todas las agregaría a un medio con tetraciclina entonces las que sobreviven no están transformadas por que las ya transformadas se les corto el gen a tetraciclina.
A mis bacterias ya transformadas las haría crecer en un medio con Ampicilina por que su resistencia aún permanece, con esto evitaría que otras bacterias que no tuvieran resistencia a ampicilina proliferen.
La estrategia de clonación 1 utiliza la(s) enzima(s) derestricción__EcoR1- BamH_____para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restricción__Kpn1-Xho1______ para cortar el gen W
La estrategia de clonación 2 utiliza la(s) enzima(s) de restricción__BanH_____para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restricción___Kpn1-Xho1______ para cortar el gen W
La estrategia de clonación 3 utiliza la(s) enzima(s) de restricción__EcoR1-Kpn1_____para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restricción__Kpn1_______ para cortar el gen W
¿En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección?
En la estrategia de clonación 1
Preguntas 2
a) Diga tres características que un plásmido debe de contener para permitir la clonación y amplificación del gen A en las células bacterianas.
• Tamaño pequeño
• Sitios de restricción útiles
• Origen de replicación
• Genes que confieren selección
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo en el plásmido?
• Xho1 y Kpn1
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A ? Explica brevemente.
• Kpn1
Posteriormente, cultivarás estas células bacterianas transformadas en un medio que te permita distinguir entre las bacterias que contengan el plásmido de las que no. En que tipo de medio de cultivo crecerías a tus bacterias transformadas. Explica tu respuesta.
El gen será insertado en una posición donde romperá una de las resistencias por un fármaco (Tet), por lo tanto crearemos 4 medios para corroborar que en verdad estos fármacos inhiben mis cultivos
• Un medio sin fármacos para las bacterias sin transformar – crecerán todas mis bacterias.
• Un medio con los dos fármacos (Tet y Amp) para las bacterias transformadas – No crecerán mis bacterias porque hay Tet y mi resistencia a este fármaco se rompió en la inserción del gen.
• Un medio con un solo fármaco (Tet) – No crecerán mis bacterias.
• Un medio con un solo fármaco (Amp) – Crecerán mis bacterias, ya que mi resistencia a Amp sigue en pie y no impide el crecimiento de mis bacterias.
Mis bacterias transformadas las cultivaría en un medio con uno solo de los fármacos, el de Amp. Al introducir el gen en mi vector rompí la resistencia por Tet, por lo tanto, si cultivo mis bacterias en un medio rico de Tet nunca crecerían.
Maximiliano Padilla.
Pregunta 1.
a) Un esquema del gen W se muestra a continuación. Si quieres clonar el gen W en el vector p202383. Menciona tres diferentes estrategias que emplearías para clonar el gen W en el plásmido p202383 y seleccionar colonias que contuvieran a un plásmido recombinante.
La estrategia de clonación 1 utiliza la(s) enzima(s) de restricción _______para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restricción_________ para cortar el gen W
• EcoRI y KpnI
• EcoRI y KpnI
La estrategia de clonación 2 utiliza la(s) enzima(s) de restricción _______para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restricción_________ para cortar el gen W
• BamHI
• BamHI
La estrategia de clonación 3 utiliza la(s) enzima(s) de restricción _______para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restricción_________ para cortar el gen W
• KpnI
• KpnI
En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección?
• En la dos.
Pregunta 2.
b) Diga tres características que un plásmido debe de contener para permitir la clonación y amplificación del gen A en las células bacterianas.
• El plásmido debe tener un tamaño relativamente pequeño, el tamaño del inserto debe de ser de aproximadamente 5 kb.
• Tiene que tener sitios de restricción útiles.
• Tiene que tener un origen de replicación.
1. ¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo en el plásmido?
• KpnI.
2. ¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A? Explica brevemente.
• KpnI. La enzima Kpn1 corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de reconocimiento, dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen secuencias nucleotídicas idénticas, son “pegajosas” (cohesivas), ya que pueden unirse a colas complementarias de otros fragmentos de DNA mediante puentes de hidrógeno.
3. Posteriormente, cultivarás estas células bacterianas transformadas en un medio que te permita distinguir entre las bacterias que contengan el plásmido de las que no. En qué tipo de medio de cultivo crecerías a tus bacterias transformadas. Explica tu respuesta.
• En un medio de ampicilina.
Como sabemos, una vez que se inserto el gen de interés, este no fue insertado en el lugar que se nos dio la gana, fue insertado en un sitio de restricción específico, de tal manera que cuando la enzima de restricción cortara esa región y el gen de interés lo fuéramos a colocar dentro del plásmido, este embonara perfectamente. En este caso, cuando insertamos este fragmento de DNA (o gen de interés), invadimos el sitio de restricción exclusivo del gen resistente para la tetraciclina, por lo tanto, esto hace automáticamente que se inactive el gen de resistencia para tetraciclina y como consecuencia, al transferir nuestro vector recombinante a las células huéspedes bacterianas para hacerlas crecer en un medio de cultivo con tetraciclina, éstas morirían, ya que su gen de resistencia para la la tetraciclina estaba inactivo.
1.A) Estrategia de clonación 1: EcoR I — Ban H (corta al gen); Kpn I — Xho I (corta al vector)
Estrategia de clonación 2: Ban H — Ban H (corta al gen); Kpn I — Xho I (corta al vector) Estrategia de clonación 3:
1.B) Ban H — EcoR I
2. A) Un tamaño relativamente pequeño del plásmido, sitios de restricción útiles, un origen de replicación y genes que codifiquen selectivamente.
2.B) Se hará crecer en un medio que contenga un fármaco resistente al gen A insertado en la bacteria. Se necesitará un segundo gen identificable (gen B) con la misma actividad enzimática del gen A o con una segunda resistencia al fármaco. La primera caja Petri, tendrá E. coli con el gen B más ampicilina; la segunda caja, tendrá E. coli, el gen A, el plásmido y ampicilina y la tercer caja tendrá E. coli, el plásmido sin niguno de los dos genes, más ampicilina. La primera mostrará al gen sin transformar, haciendo activa a la enzima del gen B; en la segunda caja habrá crecimiento bacteriano porque sí hubo transferencia, expresó el gen A resistente a ampicilina y en la tercera caja no habrá crecimiento porque no hubo gen resistente a ampicilina que se insertara en la bacteria.
Ejercicio 1:
La estrategia de clonación 1 utiliza la(s) enzima(s) de restricción___NdeI____para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restriccción___EcoRI______ para cortar el gen W
La estrategia de clonación 2 utiliza la(s) enzima(s) de restricción__EcoRI_____para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restriccción____BamHI_____ para cortar el gen W
La estrategia de clonación 3 utiliza la(s) enzima(s) de restricción____BamHI___para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restriccción___XhoI______ para cortar el gen W
¿En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección? La segunda
Ejercicio 2:
a) Diga tres características que un plásmido debe de contener para permitir la clonación y amplificación del gen A en las células bacterianas.
Tamaño relativamente pequeño
Sitios de restricción útiles
Origen de replicación
Genes que confieren selección
b) ¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo en el plásmido?Usaría Xho1 ya que se encuentra anterior a la zona del promotor.
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A ? Explica brevemente.
KpnI debido a que abarca la mayor área del gen, y del transcrito.
───── Pregunta 1 ─────
Para la estrategia de clonación 1 utilizaría la enzima de restricción Nde I y BamH I para cortar el vector y las enzimas de restricción EcoR I y Xho I para cortar el gen W. En este caso solo pensaba en utilizar una enzima de restricción para abrir el plásmido, sin embargo es necesario en todos los cortes interrumpir la expresión del gen BamH I que le confiere resistencia ante la Ampicilina, porque solo así nos daríamos cuenta de que al cultivar nuestra cepa bacteriana con el gen W de interés en un medio de cultivo con Ampicilina no crecería, mientras que en nuestro medio control sin ampicilina si crecería con el plásmido, para posteriormente solo introducir la secuencia del gen en específico.
Para la estrategia de clonación 2 utilizaría la enzima de restricción BamH I para cortar el vector y la enzima de restricción igualmente solo BamH I, para cortar el gen W, esto debido a que como observamos primero para cortar el plásmido, la enzima de restricción BamH I corta en 2 sitios y no solo en uno, de esta manera no hay necesidad de incluir otra enzima de restricción (ya que de por si son caras) y al hacer esto se interrumpe también la presencia de la resistencia a la ampicilina, lo que al cultivar nuestra cepa crecerá en un medio normal, dando positivo nuestra inserción del gen al no crecer en el medio con ampicilina. En el caso del gen W de la misma manera solo incluimos la enzima de restricción BamH I ya que está, corta en las 2 partes del gen y por lo tanto tampoco no hay necesidad de utilizar 2 enzimas distintas.
Para la estrategia de clonación 3 utilizaría las enzimas de restricción Kpn I y BamH I para cortar el vector y la enzima de restricción Kpn I para cortar el gen W. En este caso se utilizan estas enzima de restricción para cortar el plásmido porque en especial esta Kpn I como observamos va en sentido opuesto a todas las demás es decir de 3´ a 5´ y se utilizaría esta para responder la última pregunta de esta parte del ejercicio, y nuevamente Bam H I para cerciorarse al momento de cultivar nuestras cepas si se llevó a cabo de buena manera la introducción del gen W, finalmente para cortar el gen W solo se utiliza la enzima Kpn I nuevamente para introducir el gen pero con la cualidad de que este va a correr únicamente en una sola dirección, además como esta enzima en especial corta en los 2 sitios del gen W no hay necesidad de agregar otra enzimas más.
¿En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección?
R: Como ya lo mencione anteriormente, en la estrategia de clonación 3 es en donde se insertara el gen que corre únicamente para 1 sola dirección debido a la utilización de la enzima de restricción Kpn I.
──── Pregunta 2────
1. Debe tener un tamaño considerablemente (grande) de pares de bases (pb) como para poder soportar el gen de interés, pero no tan grande como para perder de lugar la secuencia de interés insertada, y así poder llevar a cabo la transformación de esta proteína o lo que se vaya a transformar.
2. Se debe de conocer específicamente cual es el origen de la replicación en el plásmido.
3. Finalmente también debe de conocer los sitios de restricción útiles dentro de este para llevar a cabo los cortes en los lugares específicos, sabiendo que regiones son en las que debes realizar el corte e introducir el gen, ya que podríamos interrumpir si no se hace de manera correcta sitios en donde existen genes de selección.
b) ¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo en el plásmido?
R: En este caso utilizaría inicialmente Xho 1 y Kpn 1, utilizaría la primera (Xho1) ya que esta enzima de restricción en el gen no cortan nucleótidos cercanos de interés para introducir el gen dentro del plásmido, además como se observa esta se encuentra a pocos nucleótidos de distancia del sitio promotor, sin el cual el gen no podría ser leído, sin embargo Kpn 1 corta al finalizar exactamente el gen lo que podría traer como consecuencias que cortara una parte esencial del gen y al momento de traducirse no se expresara de buena manera, sin embargo me voy más por esta opción ya que si utilizáramos Hind III se dañaría totalmente el gen ya que esta enzima de restricción corta en la parte intermedia del gen especifico y finalmente esta decisión la tome por que el tamaño de inserción de bp´s, debe ser al menos de 1Kbp y utilizando estas 2 enzimas se consigue un tamaño aproximado a diferencia de si solo utilizáramos Kpn 1.
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A? Explica brevemente
R: De la misma manera utilizaría Kpn1 y Xho1, ya que cortando en estos sitios específicos, en primera con Kpn 1 porque interrumpiríamos la actividad de la resistencia al antibiótico (tetraciclina) lo que nos ayudaría a diferenciar al cultivar las bacterias si la inserción del plásmido se realizó de manera correcta y en segunda con Xho 1 porque nos dan un dato y es que la distancia entre Kpn 1 y Sal 1 hay una distancia de 1Kbp, sin embargo al cortar el gen de interés es necesario abarcar un espacio mayor y al cortar con Xho 1 y no con Sal 1 obtendriamos ese espacio más necesario para insertar el gen sin problema alguno.
Posteriormente, cultivarás estas células bacterianas transformadas en un medio que te permita distinguir entre las bacterias que contengan el plásmido de las que no. En qué tipo de medio de cultivo crecerías a tus bacterias transformadas. Explica tu respuesta.
R: Lo crecería en un medio con Ampicilina, ya que si se está interrumpiendo la acción de la tetraciclina, en el medio con ampicilina crecerían solo las bacterias con el gen de interés y no aquellas en donde se encuentran las células normales que no lograron incorporar el gen o el plasmido.
-La estrategia de clonación 1 utiliza la enzima de restricción Kpn I para cortar el vector y también para cortar el gen W.
-La estrategia de clonación 2 utiliza la enzima de restricción BamH I para cortar el vector y también para cortar el gen W.
-La estrategia de clonación 3 utiliza las enzimas de restricción EcoR I o Xho I para cortar el vector y las enzimas de restricción EcoR I y Xho I para cortar el gen W.
-¿En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección?
En la estrategia 3.
a) Diga tres características que un plásmido debe de contener para permitir la clonación y amplificación del gen A en las células bacterianas.
Debe poseer la capacidad de replicación autónoma, ser lo más pequeño posible para permitir un fácil aislamiento y manejo, y contener sitios únicos de restricción y marcadores genéticos selectivos.
-¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo en el plásmido?
XhoI y KpnI.
-¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A? Explica brevemente.
XhoI y KpnI, las mismas que usaría para digerir el gen A pues así las secuencias cortadas se complementarían y podrían ligarse.
-En qué tipo de medio de cultivo crecerías a tus bacterias transformadas. Explica tu respuesta.
Las pondría en un medio que las sometiera a expresar la característica que les quiero brindar. Por ejemplo, si el gen A les brindara resistencia contra la ampicilina, haría un medio de cultivo y pondría ese antibiótico esperando que sólo las bacterias transformadas crecieran ahí. En cambio, si yo pusiera un medio sin ampicilina, ambas bacterias (transformadas y no transformadas) crecerían.
La estrategia de clonación 1 utiliza la(s) enzima(s) de restricción _BamH1_para cortar el vector y la(s) enzima (s) de restricción _EcoR1_ para cortar el gen W
La estrategia de clonación 2 utiliza la(s) enzima(s) de restricción _Kpn1 y Ecor1_para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restricción _BamH1_ para cortar el gen W
La estrategia de clonación 3 utiliza la(s) enzima(s) de restricción _Xho1 y Bam H1_ para cortar el vector y la(s) enzima(s) de restricción _Ecor1_ para cortar el gen W
¿En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección?
En la primera
a) Diga tres características que un plásmido debe de contener para permitir la clonación y amplificación del gen A en las células bacterianas.
1.- Un origen de replicación que le permite replicarse de forma independiente del cromosoma del hospedador.
2.- Algún tipo de marcador seleccionable que les permite identificar con facilidad las células que contienen el vector. Y los fragmentos de DNA unidos a él.
3.- Sitios independientes para la unión de una enzima de restricción o de varias de ellas. Esto permite la inserción de los fragmentos de DNA en un punto específico dentro de un vector íntegro.
b)
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo en el plásmido? Xho1 y Kpn1
¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A ? Explica brevemente. Xho1 y Kpn1 porque cualquier secuencia que se encuentre entre las dianas de las enzimas de restricción puede insertarse en un vector que contenga un sitio de corte igual. Esto se realiza cortando ambas moléculas con la misma enzima y dejando que se emparejen.
¿En qué tipo de medio de cultivo crecerías a tus bacterias transformadas?. Explica tu respuesta.
Generalmente el vector en que se ha ligado el DNA pasajero suele codificar una o varias enzimas que confieren resistencia a antibióticos, de forma que sólo las células que han incorporado dicho vector (con o sin pasajero) serán capaces de crecer en un medio selectivo suplementado con dicho antibiótico. Para diferenciar entre los transformantes con y sin inserto suele emplearse la capacidad de las células transformadas con vector + inserto para transformar/generar o no un sustrato/producto cromogénico.
Bibliografía:
Gabriel Dorado Pérez, Clonación del DNA amplificado mediante PCR. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.
Benjamin Lewin, 1994, Genes, Volumen 2. Editorial Reverté, Barcelona, España.
Watson James; Baker Tania; Bell Stephen; Gann Alexander; Levine Michael; Losick Richard, 2005, Biología molecular del gen, 5ta edición, Editorial Médica Panamericana, España.
Pregunta 1
La estrategia de clonación 1 utiliza la enzima de restricción Kpn I para cortar el vector y la enzima de restricción Kpn I para cortar el gen W.
La estrategia de clonación 2 utiliza las enzimas de restricción EcoRI y BamHI para cortar el vector y las enzimas de restricción EcoRI y BamHI para cortar el gen W.
La estrategia de clonación 3 utiliza las enzimas de restricción EcoRI y SalI para cortar el vector y las enzimas de restricción EcoRI y XhoI para cortar el gen W.
¿En cuál de las tres estrategias se insertaría el gen W en el vector en una sola dirección?
La tercera estrategia de clonación. Las enzimas de restricción cortan el DNA en sitios específicos generando fragmentos con extremos cohesivos de diferente longitud y secuencia de nucleótidos (algunas otras también generan cortes con extremos romos). Si dos fragmentos son cortados con el mismo tipo de endonucleasa, estos pueden ser unidos por la DNA ligasa, pero un fragmento separado por una enzima no puede ser unido a otro generado por una diferente, es decir, los extremos entre el fragmento de DNA y el vector deben ser compatibles para que la DNA ligasa pueda unirlos. Esta característica permite utilizar una combinación de endonucleasas para dar direccionalidad a la clonación.
La segunda inserta el gen en una dirección, sin embargo, la BamHI, al tener dos sitios de reconocimiento puede escindir el sitio que codifica para el gen de resistencia a ampicilina eliminando el marcador de selección que nos permite diferenciar la inserción exitosa del fragmento de DNA al vector.
Pregunta 2
a) Diga tres características que un plásmido debe de contener para permitir la clonación y amplificación del gen A en las células bacterianas.
Requiere un origen de replicación compatible con el de la célula hospedera, un marcador de selección que permita distinguir las células bacterianas transformantes (que han recibido el plásmido) y un sitio múltiple de clonación, es decir, regiones de reconocimiento para la separación por medio de una o más endonucleasas.
b) ¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el gen A para insertarlo en el plásmido?
Utilizaría XhoI y Kpn I. Las enzimas SalI o HindIII cortan la región codificante del gen por lo que este perdería su función y no produciría la proteína que permite la conservación de alimentos.
c) ¿Cuáles enzimas de restricción (KpnI, HindIII, SalI, XhoI) usarías para digerir el plásmido, antes de la inserción del gen A? Explica brevemente.
Usaría las mismas enzimas XhoI y Kpn I para que la clonación fuera direccional y permita la expresión del gen. El corte y la inserción del gen A utilizando Kpn I resulta en la inactivación del gen que codifica para la resistencia a tetraciclina, no obstante, se tiene el gen de resistencia a ampicilina que en conjunto pueden servir como elementos para la identificación de las bacterias transformantes.
d) Posteriormente, cultivarás estas células bacterianas transformadas en un medio que te permita distinguir entre las bacterias que contengan el plásmido de las que no. En qué tipo de medio de cultivo crecerías a tus bacterias transformadas. Explica tu respuesta.
Se cultivan en un medio selectivo sólido que permite la formación de colonias aisladas y el crecimiento de las células bacterianas transformantes. La selectividad es proporcionada por la adición de dos antibióticos: ampicilina y tetraciclina.
Se inoculan cuatro cajas Petri: una caja con ampicilina y tetraciclina y bacterias no transformadas (control positivo), una caja con medio sin antibióticos y sin inóculo (control negativo), una caja con ampicilina y una con tetraciclina. En la caja sin inóculo no se observaría crecimiento si la técnica de trabajo fue adecuada y no hay contaminación en el medio de cultivo. Así mismo, en las cajas con ampicilina y tetraciclina y tetraciclina no habría desarrollo de colonias puesto que las bacterias no transformadas no son resistentes a dichos antibióticos y en el segundo caso, si la integración del fragmento de DNA fue exitosa el gen de resistencia a tetraciclina fue inactivado por lo que las bacterias no crecerían. Por último, en la caja que contiene ampicilina crecerían colonias sólo si el fragmento fue acoplado al vector.
Literatura consultada
Sambrook J., Russel D. 2001. Molecular cloning a laboratory manual. 3° ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. China.
Molecular genetics of bacteria. 4° ed. J. Dale, Park S. John Wiley & Sons. 2003. England. 346 pp.
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