Biotecnología 1. Tarea 7.
Repaso para el examen, puede ser entregado hasta el lunes 28 de abril:
Haciendo una biblioteca de cDNAs clonas los fragmentos de cDNA hacia un sitio único de restricción EcoRI en el vector. Identificas el vector recombinante que consideras que tiene el gen de interès.
1. ¿Cómo puedes usar el sitio de restricción EcoRI para ver si tu gen se ha insertado en el vector?
Suponiendo que encuentres tu gen favorito en el vector, ahora tienes que hacer un mapa de restricción del plásmido recombinante. Tomas tres muestras independientes del plásmido y se digiere una con EcoRI, la segunda con HindIII y la tercera con la combinación de EcoRI y HindIII. Corres una electroforésis para visualizar los fragmentos:
Carril 1 EcoRI
Carril 2 HindIII
Carril 3 EcoRI + HindIII
los pesos moleculares se indican en los números laterales en KB
-¿Cuál es el tamaño del plásmido?
2. Considerando que el cDNA es más pequeño que el vector.
-Señala que fragmentos del gel contienen una parte o todo el cDNA
-Dibuja el mapa de restricción de este plásmido recombinante.
Para los dibujos de los mapas de restricción, me los entregan en clase.
3. Dada la secuencia siguiente, diseña el par de primers, cada uno de 18 nucleótidos de longitud que te permitiría amplificar miles de copias de un producto de PCR de 400 pb de la siguiente secuencia:
En el esquema, indica donde serían complementarios cada uno de los primers propuestos.
Escribe la secuencia de los primers, ambos en dirección 5′ – 3′
Primer F:
Primer R:
10 comentarios
1. ¿Cómo puedes usar el sitio de restricción EcoRI para ver si tu gen se ha insertado en el vector?
Hacer una digestión del vector y después correrlo en una electroforesis, para identificar las partes donde corto EcoRI verificando que fragmento es el gen.
¿Cuál es el tamaño del plásmido?
El plásmido mide 5.3 Kb.
2. Señala que fragmentos del gel contienen una parte o todo el cDNA.
Los fragmentos de 1.1 Kb y de 0.4 Kb del 3° carril; el fragmento de 1.5 Kb del 1° carril.
3. Esquema de primers complementarios los entrego en dibujo.
Escribe la secuencia de los primers, ambos en dirección 5′ – 3′
Primer F: AAA AAA GAA TTC GGA CCG CGG GGC
Primer R: AAA GGG CTC GAG CTT GGA TGG ATG TAA
Si el vector cuenta con las características propias de un buen plásmido como el origen de replicación, y sobre todo, genes de selección e incluso reporteros que contengan dentro de su secuencia el sitio de corte EcoRI, entonces se pueden seleccionar las colonias en las cuales se haya insertado el gen de interés gracias a que la inserción provocaría un corrimiento en el marco de lectura del gen reportero o de selección.
-¿Cuál es el tamaño del plásmido?
6.8Kb
El fragmento de 1.5 Kb representa el gen completo, mientras que los fragmentos de 1.1 Kb y 0.4 Kb contienen solo una fracción del gen de interés.
Forward: 5`CCTGGCGCCCCGTCCTAA3`
Reverse: 5`GAACCTACCTACATTATA3`
3`—–5`
5`————————3`
3`————————5`
5`—–3`
RESPUESTAS
1.-En mi plásmido tendría un gen de resistencia, como por ejemplo el gen Amp (de resistencia a la ampicilina) y ahí tendría mi sitio de restricción, por lo tanto, cuando tenga mis placas, si crece mi bacteria hospedera en el medio con ampicilina, quiere decir que no se metió mi inserto, pero si no crece, quiere decir que si se metió, ya que la enzima de restricción EcoR1 partío al gen Amp.
1.2 ¿Cuál es el tamaño del plásmido?
R= 6.8 Kb
2. Mapas de restricción (se entrega en clase)
3. Primers en las secuencias
1. ¿Cómo puedes usar el sitio de restricción EcoRI para ver si tu gen se ha insertado en el vector?
Se puede utilizar un marcador de selección, es decir se hace uso de un gen reportero para poder identificar la presencia del gen utilizando el sitio de restricción. Se crecen las bacterias en un medio de cultivo selectivo.
-¿Cuál es el tamaño del plásmido?
El tamaño del plásmido es de aproximadamente 6.8 Kb
2. Considerando que el cDNA es más pequeño que el vector.
-Señala que fragmentos del gel contienen una parte o todo el cDNA.
Se encuentra entre las 3 y las 2.3 Kb
3. Diseñar primers
Primer F: A TGGCGCCCCGTCCTAACG
Primer R: C TTTGTCGGGCCTCGTTAG
1. ¿Cómo puedes usar el sitio de restricción EcoRI para ver si tu gen se ha insertado en el vector? se realizaría medios de cultivo en donde se podrían a crecer, con la inoculación de EcoRI en una caja petri en en otra se podrían EcoRI + enzima de restricción, en donde sino crece significa que el gen se inserto.
-¿Cuál es el tamaño del plásmido? El tamaño del plásmido es de 6.8 kb
En el esquema, indica donde serían complementarios cada uno de los primers propuestos
Seria en la parte de arriba del segmento a 5′ – 3′, donde el primer iría de 3´- 5 y abajo en la parte 3´- 5, la direccion del primer es de 5′ – 3′
Escribe la secuencia de los primers, ambos en dirección 5′ – 3′
Primer F:AATCCTGCCCCGCGGTCC
Primer R:CTTGGATGGATGGATGTA
Haciendo una biblioteca de cDNAs clonas los fragmentos de cDNA hacia un sitio único de restricción EcoRI en el vector. Identificas el vector recombinante que consideras que tiene el gen de interès.
1. ¿Cómo puedes usar el sitio de restricción EcoRI para ver si tu gen se ha insertado en el vector?
R: Pues se podría introducir en el plásmido una resistencia ante un antibiótico en donde se encuentre este sitio de restricción y este insertarse en una bacteria, para diferenciar si es que se encuentra bien introducido, las bacterias con el cDNA crecerían, mientras que las que no lo incorporaron de buena manera no.
También se podría hacer uso de un marcador fluorescente específico para alguna región del cDNA que al entrar en contacto con un estímulo se pueda observar la fluorescencia por medio de un citometro de flujo, el cual nos indicaría el porcentaje de plasmidos que lo poseen.
Suponiendo que encuentres tu gen favorito en el vector, ahora tienes que hacer un mapa de restricción del plásmido recombinante. Tomas tres muestras independientes del plásmido y se digiere una con EcoRI, la segunda con HindIII y la tercera con la combinación de EcoRI y HindIII. Corres una electroforésis para visualizar los fragmentos:
-¿Cuál es el tamaño del plásmido?
R: El tamaño del plásmido es de 6.8 – 7 KB.
2. Considerando que el cDNA es más pequeño que el vector.
-Señala que fragmentos del gel contienen una parte o todo el cDNA.
R: Los poseen el carril número 3 de la electroforesis, en donde utilizan a EcoRI y a HindIII, ya que como menciona al inicio del problema, se clona todo el cDNA dirigido al sitio perteneciente a EcoRI, por esta premisa uno pensaría que todo el cDNA clonado se encontraría en el carril de la electroforesis 1 en donde se utiliza la enzima de restricción EcoRI, sin embargo no todo el cDNA se encuentra ahí, dado que el bandeo en la electroforesis también existe con la enzima de restricción para HindIII lo que sugiere que en ese sitio en donde se realizó el corte hay también información de cDNA por lo que finalmente al utilizar estas 2 enzimas en un solo vector se abarcaría de gran manera a todo el cDNA y esa es en el carril 3 de la electroforesis, en donde utilizan a EcoRI y a HindIII ya que cortarían a lo largo de todo el plásmido, abarcando mayor información genética (cDNA) no solo la contenido por EcoRI o la de HindIII, sino más bien las 2 juntas.
3. Dada la secuencia siguiente, diseña el par de primers, cada uno de 18 nucleótidos de longitud que te permitiría amplificar miles de copias de un producto de PCR de 400 pb de la siguiente secuencia:
En el esquema, indica donde serían complementarios cada uno de los primers propuestos.
r: La verdad es que ya me la pase un muy buen tiempo buscando regiones que sean complementarias entre si y no encuentro ninguna bastante consistente, esto debido a que no puedo tomar nucleotidos de la segunda fila o mas, ya que si asi lo hiciera al momento de correr el PCR ya no se obtendria la secuencia de 400, sino mas bn una de 270, esto no serviria para amplificar pues se pierde bastante informacion durante este proceso de buscar la region con mas similaridad.
Ahora si bien existen regiones que comparten algunos aa no se cual escoger por que muchas de estas solo presentan unos 7 aa compartidos de los 18 por los cuales debe estar conformado el primer y si no se posee una gran similitud entre la hebra 5´ y la 3´ el PCR simplemente no correrá con la misma especificidad para poder comenzar a correr hasta el final, sin embargo si se redujera el numero de aa que debe de tener el primer u oligo, quizás seria un poco más fácil encontrar una region complementaria, aunque se sacrificara a su vez especificidad por que esa región también podría encontrarse en otra parte de la hebra abierta del cDNA.
Escribe la secuencia de los primers, ambos en dirección 5′ – 3′
Primer F:
Primer R:
1.- Suponiendo que nuestro gen está dentro del sitio de restricción y que su función, por ejemplo, confiera resistencia a un antibiótico, podríamos demostrar la primicia mediante un cultivo prueba es decir: de la misma cepa transformada dividir la muestra en dos una en la que la restricción se haya llevado a cabo y otra en la que no. De esas dos muestras hacer crecer las bacterias(de las dos muestras obtenidas anteriormente) en dos medios diferentes:
*1: Medio con el antibiótico al que se supone nuestro gen hace resistente a la célula + nutrientes esenciales.
*2: Medio con nutrientes esenciales.
Los resultados esperados son los siguientes:
Para las células SIN tratamiento de restricción se espera que haya crecimiento en ambos medios.
Para las células CON tratamiento de restricción se espera que sólo haya crecimiento en el medio con nutrientes esenciales, pues si nos basamos en el supuesto de que nuestro gen está dentro del sitio de restricción al momento del tratamiento este fragmento se pierde y por lo tanto no produce la proteína que le permitiría proliferar en un medio con el antibiótico. Demostrando entonces que la proteína está dentro del sitio.
2.- GEL
¿Cual es el tamaño del plásmido?
6.8 kilo bases
3.-PRIMER
El primer «F» es complementario en sentido 3’=>5′ a la cadena 5’=>3′ del esquema.
El primer «R» es complementario en sentido 5’=>3′ a la cadena 3’=<5' del esquema.
F: C T T G G A T G G A T G T A A T A T
R: G G A C C G C G G G G C A G G A T T
Haciendo una biblioteca de cDNAs clonas los fragmentos de cDNA hacia un sitio único de restricción EcoRI en el vector. Identificas el vector recombinante que consideras que tiene el gen de interés.
1. ¿Cómo puedes usar el sitio de restricción EcoRI para ver si tu gen se ha insertado en el vector?
Como sabemos, las enzimas de restricción sólo cortan el DNA si reconocen en su interior una secuencia específica de nucleótidos. Las enzimas de restricción que se descubrieron en la bacteria Escherichia coli se denominan Eco. Existen diferentes tipos de enzimas Eco que se diferencian en la secuencia que reconocen y cortan. Hay un solo tipo de corte que realiza esta enzima de restricción, generando extremos cohesivos tanto en el vector como en el gen de interés, y estos por lo tanto son complementarios. Así que podemos usar el sitio de restricción EcoRI marcando los extremos cohesivos de tal manera que cuando se unan los extremos cohesivos del gen de interés, se dé una interacción (flouróforo, etc.) y así sepamos que nuestro gen se inserto con éxito.
-¿Cuál es el tamaño del plásmido?
6.8 – 7 kb.
2. Considerando que el cDNA es más pequeño que el vector.
-Señala que fragmentos del gel contienen una parte o todo el Cdna
Todos los fragmentos del carril 3 EcoRI + HindIII contienen una parte del cDNA, ya que al ser 4 fragmentos con pesos moleculares un poco menores que los de los otros 2 carriles, estos pueden albergar una parte del cDNA.
Dada la secuencia siguiente, diseña el par de primers, cada uno de 18 nucleótidos de longitud que te permitiría amplificar miles de copias de un producto de PCR de 400 pb de la siguiente secuencia:
3’-GGCCCGACAAAGTACTGA-5’
1 5’–––––––––––––––––––––––––––––––––––3’
3’––––––––––––––––––––––––––––––––––– 5’
5’-ATGACTTGGATGGAAAAG-3’
Escribe la secuencia de los primers, ambos en dirección 5′ – 3′
Primer F: 5′-AGTCATGAAACAGCCCGG-3′
Primer R: 5′-ATGACTTGGATGGAAAAG-3′
1. ¿Cómo puedes usar el sitio de restricción EcoRI para ver si tu gen se ha insertado en el vector?
Suponiendo que el sitio de restricción EcoRI esta dentro del gen responsable de la capacidad de formar colonias azules sembradas en un medio con la sustancia X-gal entonces la insersion de nuestro gen de interés en nuestro vector puede corroborarse si se interrumpe la capacidad de expresar esta coloración azul. Así los plasmidos que contienen segmentos de nuestro gen insertado producirán colonias blancas, mientras que los que no tienen insertos producen colonias azules.
Cual es el tamaño del plasmido?
6.8 KB
3. Indica donde serían complementarios cada uno de los primers propuestos.
5′ ———————– 3′
Primer F 3′—- 5′
3′ ———————– 5′
5′ —- 3′ Primer R
Escribe la secuencia de los primers, ambos en dirección 5′ – 3′
Primer F: CTTGGATGGATGTAATAT
Primer R: GGACCGCGGGGCAGGATT
1. ¿Cómo puedes usar el sitio de restricción EcoRI para ver si tu gen se ha insertado en el vector?
Con EcoRI se escinde el vector y los fragmentos de cDNA. Después de realizar la ligación, para identificar el vector recombinante se puede utilizar un marcador de selección que permita distinguir las células bacterianas transformantes, por ejemplo, con la adición de un gen de resistencia a antibióticos como la tetraciclina o la ampicilina.
2. ¿Cuál es el tamaño del plásmido? 6.8 Kb
Carril 1 EcoRI: dos fragmentos de 5.3 Kb y 1.5 Kb.
Carril 2 HindIII: dos fragmentos de 4.1 Kb y 2.7 Kb.
Carril 3 EcoRI + HindIII: cuatro fragmentos de 3 Kb, 2.3 Kb, 1.1 Kb, 0.4 Kb.
2.1 Considerando que el cDNA es más pequeño que el vector, señala que fragmentos del gel contienen una parte o todo el cDNA
En el carril 1, el amplicón que contiene el cDNA es el de 1.5 Kb.
En el carril 2, es el fragmento de 2.7 Kb.
3. Escribe la secuencia de los primers, ambos en dirección 5’-3’
Primer F: 5’CAATCCTGCCCCGCGGTCC3’
Primer R: 5’CATATTACATCCATCCAAG3’
Los primers deben ser complementarios a la cadena que tiene una dirección 5’-3’ puesto que esta es la dirección en que se lleva a cabo la replicación. Los primers deben diseñarse siguiendo una secuencia molde; en este ejercicio fueron diseñados siguiendo una secuencia de 19 nucleótidos pues se debe cuidar que el extremo 3’ de los primers esté fuertemente unido a la cadena molde utilizando una guanina o citosina.
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