¿Importará elección de primers al comparar comunidades microbianas en diferentes ambientes?

En estudios de microbioma especialmente cuando se analizan comunidades de bacterias y arqueas es bien sabido que basta con comparar secuencias del gen ribosomal 16S por lo conservado que se encuentra en estos organismos, y es muy útil que sea tan general para analizar inclusive en diferentes ambientes.

Pero ¿qué tan bien se realizan estas comparaciones de microbiomas?, además, siempre que se obtenga el DNA metagenómico ¿importará de qué forma sea extraído?, a eso hay que sumarle al hecho de que dentro de la estructura del gen 16S hay 9 regiones hipervariables que sirven para diferenciar entre géneros y hasta especies, pero ¿cuál es la región más adecuada para realizar esas comparaciones? ¿Se pueden hacer comparaciones de comunidades cuando la secuenciación se hizo de diferentes regiones?

En este artículo se hacen esas preguntas mediante la secuenciación de diferentes microecosistemas que están relacionados con la salud humana, con una visión de entender el ecosistema microbiano en el que nos encontramos involucrados en la cadena alimentaria. 

Este análisis lo realizan mediante la secuenciación de amplicones de diferentes pares de primers del gen 16S rRNA que corresponden a diferentes regiones (P1: V3-V4 [787F-1073R], P2: V4 [799F-1193R], P3: V5-V6 [515F-806R], P4: V5-V6-V7 [341F-805R]). 

Con conclusión general la influencia de los kits de extracción de DNA fue insignificante en comparación con la influencia de la elección de los pares de cebadores. Café preguntarse como sustentan éstas conclusiones

Primero los autores analizan in silico la cobertura que puede darles analizar todas las regiones hipervariables V del 16S al compararlos en bases de datos como la de SILVA para determinar si se podrían utilizar para identificar taxones pertenecientes a los tres dominios, siendo que el par P3 (primer primer 515F) sí abarca los tres dominios, aunque en puntuaciones bajas, además hay dos primers que son específicos de bacterias 1073R y 1193R .

Hacen la comparación real de primers de diferentes microecosistemas, desde un mock (que es definido como una comunidad conocida definida previamente), ratones gnotobióticos como controles, y para constuir la idea de la cadena alimenticia analizan los microbiomas de suelos, raíces de plantas, y heces de ganado vacuno y humano. Quizás un problema es que utilizan muestras diferentes para cada tipo de muestra y en los posteriores análisis las usan como si fueran equivalentes.

Primero descartan que el uso de diferentes kits de extracción de DNA influya en el resultado de cualquiera de los análisis de diversidad, por lo que uno no debería de preocuparse tanto por no recuperar algún grupo taxonómico.

Un resultado sorprendente de los datos experimentales es que cada par de primers da un número diferente de lecturas secuenciadas, desde 3 a 5 M de secuencias dependiendo del par elegido.

Es sorprendente que la elección de los pares de primers sí influencia la composición de la diversidad, por ejemplo de los 955 géneros encontrados en total, sólo 348 fueron comúnmente identificados en todas las muestras, además el par P3 515F-806R identificó el mayor número de géneros (n = 696).

Además a lo largo de los microbiomas hay 4 phyla que están presentes: Firmicutes, Bacteoridetes, Actinobacteria y Proteobacteria, solamente los pares P3 y P4 detectan dos filos de arqueas, además los autores mencionan que la riqueza de las comunidades va disminuyendo conforme avanza la cadena alimentaria, con humanos (consumidores secundarios) teniendo la menor diversidad.

Por otra parte la diversidad beta de las comunidades (índices de Jaccard y Bray-Curtis) también fue de influenciada por la elección de primers, además el par de primers sí influye en qué comunidad se está analizando, como el par P3 que sirvió para observar la dispersión de los puntos de suelo en un gráfico NMDS.

Particularmente para cada par de primers es común encontrar diferencias en la abundancia de taxones específicos, y estás diferencias son significativas, lo cual hace pensar que hay regiones del gen 16S que son muy sensibles a la identificación taoxnómica.

Finalmente este trabajo hace la sugerencia de que las investigaciones con 16S consideren tomar solo uno de estos pares de Primers (515F-805R) para hacer comparaciones entre distintos estudios como una forma de estandarizar la forma de trabajo.

Sin embargo, estos análisis deben verse críticamente:

Es interesante que utilicen los controles de la comunidad conocida del ‘mock’ y de los ratones gnotobióticos, sin embargo controles afectados serían quizás usar comunidades sintéticas cada vez más diversas y ver si hay realmente diferencias con los suelos o plantas que pierden de distintas muestras.

Al comparar entre diferentes muestras, puede que se estén explicando éstas diferencias con el origen mismo de la muestra, ya que hay mucha variación tanto en la diversidad alfa como en la diversidad beta pero está puede ser por las muestras distintas dónde se toman.

Cómo última opinión quizás sería mejor realizar la secuenciación del gen 16S completo para poder aseverar si hay regiones donde sea más sensible la taxonomía.

Referencia: Wasimuddin, Schlaeppi, K., Ronchi, F., Leib, S. L., Erb, M., & Ramette, A. (2020). Evaluation of primer pairs for microbiome profiling from soils to humans within the One Health framework. Molecular ecology resources, 20(6), 1558-1571. https://doi.org/10.1111/1755-0998.13215