El número de flagelos en Pseudomonas bijieensis 2P24 influye en la capacidad de colonización del trigo
Las raíces de las plantas ejercen presión selectiva sobre los microorganismos que las colonizan, favoreciendo la aparición de características que otorgan ventajas a los habitantes que viven en su cercanía. Mediante la evolución exprimental y aprovechando el potencial adaptativo de las bacterias, es posible estudiar los cambios en su genoma que resultan de la selección ejercida por la planta y representan adaptaciones a la vida en las raíces. Estos experimentos consisten en el contacto prolongado de las bacterias con plantas del mismo genotipo, guíando así la trayectoria evolutiva de las bacterias a lo largo de múltiples generaciones.
En este estudio, se utilizó Pseudomonas bijieensis 2P24 como punto de inicio en la evolución experimental. Con esta cepa ancestral, se inocularon semillas de trigo desinfectadas creciendo en medio mínimo estéril, eliminando así la competencia con otros microorganismos y estableciendo la presión selectiva restringiendo las fuentes de carbono a los compuestos liberados por la planta. Utilizando este sistema se establecieron cuatro líneas independientes, cada una albergando poblaciones distintas de P. bijieensis 2P24 provenientes de la misma cepa ancestral. Se llevaron a cabo 8 pases seriales con una duración de 10 días cada uno, al final de este periodo se aislaron las bacterias de las raíces y fueron nuevamente inoculadas en semillas de trigo. Para cada ciclo se reralizó el conteo de UFCs para estimar el tamaño de la población y cada dos ciclos se eligieron colonias al azar para su almacenamiento y secuenciación de genoma completo.
Durante los dos primeros ciclos, las cuatro poblaciones presentaron los valores máximos de tamaño de población, los cuales disminuyeron en ciclos posteriores y permanecieron constantes durante el resto del experimento. Esto sugiere una reestructuración en la comunidad debido a cambios adaptativos que ocurrieron de manera independiente en las cuatro poblaciones. Para identificar mutaciones responsables de este comportamiento, se secuenció el metagenoma de la población completa en los ciclos 2, 4, 6 y 8; comparandolos con el genoma de la cepa ancestral de identificaron 7 polimorfismos de nucleótido único en las cuatro líneas. Cada población presentó una mutación diferente en el gen fleN, las cuales comenzaron desde el ciclo 4 e incrementaron con el tiempo alcanzando frecuencias de hasta el 49%, indicando su importancia en la adaptación al ambiente de las raíces. En cambio, otras mutaciones en los genes hisM, baeS y COJ56-RS12475 ocurrieron de manera intermitente en cada una de las poblaciones, sugiriendo un posible origen no relacionado con la selección ejercida por la planta.
La frecuencia de las mutaciones en fleN calculada a partir del metagenoma fue validada mediante la selección al azar de 10 colonias del último ciclo de cada línea y secuenciando amplicones de fleN. evidenciando proporciones similares similar a lo calculado mediante datos metagenómicos. Mediante recombinación homóloga, se construyeron mutantes con los cambios correspondientes a cada SNP y evaluó la influencia de cada polimorfismo en la capacidad de colonización de las raíces, monitoreando el tamaño de la población durante 10 días. Todas las mutantes mostraronpoblaciones de mayor tamaño respecto a la cepa ancetra, a pesar de que el incremento no fue significativo en FleNV24L en el tiempo final.
Adicionalmente se realizaron experimentos de colonización competitiva, utilizando como inóculo un medio con igual proporcion de células de la cepa ancestral y cada una de las mutantes, utilizando tanto aquellas generadas por recombinación homóloga y las obtenidas de la rizósfera al final del octavo ciclo. Debido a que la cepa ancestral es resistente a tetraciclina, para este experimento se sustituyó este gen por uno de resistencia a kanamicina, permitiendo así separar ambos genotipos al final del experimento, plaqueando en medios con el antibiótico correspondiente. La aptitud relativa fue calculada como la tasa de mutantes fleN respecto a la cepa ancestral al final del experimento, dividida entre la tasa al inicio del experimento. Las bacterias con cualquiera de las cuatro mutaciones mostraron una mayor aptitud respecto a la cepa ancestral y en todos los casos las mutantes generadas por recombinación homóloga presentaron una mayor aptitud que los genotipos evolucionados en la rizósfera. Esto podría ser un resultado de la exposición prolongada a la planta, que involucra compromisos en la colonización con otros fenotipos no explorados en el estudio.
En la rizósfera del tomate, únicamente las mutantes FleNV24L y FleNA139V mostraron una aptitud significativamente mayor respecto al ancestro, indicando condiciones diferentes en ambas rizósferas y posiblemente una ventaja menos específica para ambas mutaciones.
El gen fleN está involucrado en la regulación del número de flagelos presentes en las bacterias, por lo que la ventaja en la colonización podría esta relacionado a cambios en la motilidad resultante de un número distinto de flagelos. Mediante observacioens con microscopía electrónica de transmisión se contaron los flagelos presentes en la cepa ancestral, las mutantes obtenidas por el experimento de evolución artificial y una en la que se deletó el gen fleN. Se obserbó que las mutantes mostraron un incremento en el número de flagelos respecto al ancestro, mientras que ΔfleN tuvo el número máximo. Evaluando la capacidad de swarming, se encontró mayor motilidad en tres de las mutantes mientras que la capacidad de formación de biofilm fue menor respecto a la cepa ancestral. No hubo diferencias en la capacidad de crecimiento en medio líquido entre mutantes y la cepa ancestral, indicaando que un mayor número de flagelos podría representar una ventaja en la rizósfera debido a mejor motilidad y no a un incremento en la capacidad de crecimiento.
FleN contribuye a cambios en el número de flagelos mediante la unión a hexámeros de FleQ, los cuales hidrolizan ATP y en esta conformaicón se unen a σ54, permitiendo la transcripción de los genes flagelares. Debido a que FleN también tiene actividad ATPasa, compite con FleQ por ATP, el cual al unirse a FleN permite la dimerización de FleN, impidiendo así la transcripción. En la cepa ancestral, el equilibrio entre ambos estados de activación y represión de la transcripción resulta en el número observado de flagelos. En cambio, ΔfleN constantemente transcribe los genes flagelares, resultando en un incremento de la cantidad de flagelos. En el caso de las diferentes mutantes de fleN, podría haber un cambio en la capacidad de dimerización, lo cual resultaría en una menor tasa de inhibición de la transcripción, resultando en un fenotipo que se aproxima al de ΔfleN. Esto fue evaluado mediante un experimento de doble híbrido en bacteria, revelando una mayor intracción entre monómeros de FleN en la cepa ancestral, respecto a las proteínas con las sustituciones observadas en cada población.
Esta capacidad disminuída de formar dímeros también resultó en una mayor actividad ATPasa de FleQ al estar en contacto con FleN mutantes, indicando que durante la regulación génica habría una mayor transcripción de los genes flagelares. Esto último fue validado mediante RT-qPCR de los genes fleS y fleR, los cuales están regulados por la interaccion entre FleN y FleQ, mostrando que la ausencia de FleQ ocasiona un incremento en su transcripción, con los genotipos mutantes mostrando un nivel intermedio entre ΔfleN y la cepa ancestral.
Este trabajo indica que adaptaciones a la rizósfera pueden involucrar pequeños cambios en el genoma que impactan en la regulación de la trancripción y con ello afectando el éxito de los microorganismos en las raíces. A través de un incremento en el número de flagelos y mayor motilidad, las bacterias podrían colonizar rápida y ampliamente los nichos disponibles en la raíz.
La variación en el número de flagelos podría ser benéfica en otros ambientes, en donde pequeños cambios a nivel de regulación favorecerían la supervivencia de las bacterias. De igual manera, es interesante especular los cambios que podrían ocurrir como resultado de la interacción con otras plantas, en donde
Referencia
Li, J., Zhang, Y., Jiang, W., & Zhang, L.-Q. (2025). Experimental evolution of plant rhizobacteria reveals emerging adaptive mutations. mBio, 16(8), e01023-25. https://doi.org/10.1128/mbio.01023-25
