Uso de sistemas CRISPR/Cas para la detección de virus que infectan plantas de tomate

El virus rugoso del tomate marrón (ToBRFV, por sus siglas en inglés) se ha convertido en uno de los patógenos más preocupantes para la agricultura mundial. Este virus de ARN de una sola cadena de sentido positivo, pertenece al género Tobamovirus y afecta principalmente a tomate (Solanum lycopersicum) y pimiento (Capsicum annuum). Fue reportado por primera vez en 2014 en invernaderos de Israel y Jordania, y desde entonces ha demostrado una extraordinaria capacidad de propagación, tanto a nivel local como internacional, al transmitirse de manera mecánica (por contacto con herramientas, ropa o manos) y por semillas. Su rápida expansión lo ha llevado a considerarse una pandemia en plantas, con presencia ya confirmada en más de 45 países. Una de sus características más alarmantes es su habilidad para superar la resistencia genética que hasta hace pocos años protegía a las variedades comerciales de tomate. Genes como Tm-1, Tm-2 y Tm-22, que habían sido efectivos contra otros tobamovirus, no ofrecen protección frente a ToBRFV. Los daños en los cultivos incluyen necrosis en hojas, deformación y rugosidad en los frutos, lo que afecta gravemente la calidad y el rendimiento agrícola.

Fig 1. Phenotypic effects of ToBRFV-infected plants and classical detection. (A) Genome architecture of ToBRFV. Each number indicates where an open reading frame (ORF) begins and ends in a representative Iranian ToBRFV isolate (OP557566, 6393 bases). (B) Images of S. lycopersicum L. plants infected by ToBRFV. (i) Mock-treated plants; and (ii) infected plants showing necrosis. C) Gel electrophoresis image showing the expected viral product upon RT-PCR (total RNA was used as starting material).

Hasta ahora, la detección de ToBRFV se realizaba principalmente con técnicas serológicas como ELISA o moleculares como RT-PCR. Aunque son eficaces, estas pruebas requieren varias horas, personal especializado y equipos de laboratorio, lo que limita su uso en el campo. Otros métodos, llamados isotérmicos como LAMP han sido propuestos para acortar los tiempos de diagnóstico, pero pueden presentar problemas de falsos positivos. Frente a estas limitaciones, los autores resaltan que es esencial desarrollar técnicas que sean rápidas, sensibles, específicas y aplicables directamente en condiciones agrícolas. Para esto, los sistemas CRISPR-Cas se presentan en este trabajo como una alternativa innovadora. Originalmente descubiertos como parte del sistema inmune de bacterias y arqueas, los sistemas CRISPR han sido ampliamente aplicados en biotecnología, principalmente para edición genética. Sin embargo, también pueden adaptarse para diagnóstico molecular, gracias a su capacidad de reconocer secuencias específicas de ADN o ARN y activar una actividad de corte colateral sobre moléculas reporteras. Esta propiedad permite diseñar pruebas altamente específicas para detectar virus, incluidas enfermedades de plantas.

En este estudio se evaluó la capacidad de Cas12a y Cas9 para detectar ToBRFV en muestras de tomate. Para ello, el genoma viral se amplificó mediante la técnica isotérmica RPA (amplificación mediada por recombinasa), lo que evita el uso de termocicladores. Posteriormente, se emplearon complejos CRISPR programados para reconocer regiones específicas del virus, particularmente en el gen que codifica la proteína de la cápside. Una vez activadas, las nucleasas procesaron sondas de ADN de cadena sencilla marcadas con fluoresceína y biotina, lo que permitió revelar el resultado en un dispositivo de flujo lateral (LFA), similar en funcionamiento a una prueba rápida de embarazo o COVID-19.

Fig 2. Detection of ToBRFV with CRISPR-Cas12a. (A) Scheme of the detection in which the RPA product (dsDNA) generated from the viral genome is recognized by a programmed ribonucleoprotein (formed by L. bacterium Cas12a and ToBRFV-targeting crRNA) that in turn cleaves an ssDNA probe [labelled with fluorescein (F) and biotin (B)]. A commercial LFA strip is used to reveal the detection. (B) Image of the LFA strips when detecting ToBRFV in tomato plant samples (performed in triplicate). ToBRFV-derived dsDNA generated by RPA. (C) Quantification of test line intensity (bars represent means and standard deviations, n = 3). *Statistically significant change by a t-test, P < 0.05.

Los resultados mostraron que el sistema Cas12a detecta de manera eficiente al virus, con señales visibles tras 1 hora de reacción, manteniendo buena sensibilidad incluso con variaciones en la concentración de enzima. También, se probó la detección con Cas9, otra nucleasa del sistema CRISPR, que se diseñó para reconocer la misma región del ADN viral. En este caso, se utilizó una sonda compuesta por una cadena de timinas (T18), igualmente marcada para ser procesada por Cas9 al activarse.

Fig 3. Detection of ToBRFV with CRISPR-Cas9. (A) Scheme of the detection in which the RPA product (dsDNA) generated from the viral genome is recognized by a programmed ribonucleoprotein (formed by S. pyogenes Cas9 and ToBRFV-targeting crRNA) that in turn cleaves an ssDNA probe [labelled with fluorescein (F) and biotin (B)]. A commercial LFA strip is used to reveal the detection. (B) Image of the LFA strips when detecting ToBRFV in tomato plant samples (performed in triplicate). ToBRFV-derived dsDNA generated by RPA. (C) Quantification of test line intensity (bars represent means and standard deviations, n = 3). *Statistically significant change by a t-test, P < 0.05.

La investigación concluye que las pruebas basadas en CRISPR permiten un diagnóstico en menos de 1.5 horas, a temperaturas constantes y sin necesidad de equipos sofisticados, lo que las convierte en un método prometedor para monitorear enfermedades en cultivos agrícolas. Si bien aún existen limitaciones prácticas, este estudio sienta las bases para desarrollar kits portátiles de detección de virus en plantas. Los sistemas CRISPR ofrecen un enorme potencial en agricultura, no solo para diagnosticar patógenos, sino también como herramientas de edición genética, estas aplicaciones podrían revolucionar la gestión de enfermedades agrícolas y contribuir significativamente a enfrentar los desafíos de la seguridad alimentaria global.

Referencia:

Besati, Masoud, et al. “Detection of Tomato Brown Rugose Fruit Virus through CRISPR-Cas12a and CRISPR-Cas9 Systems.” Scientific Reports, vol. 15, no. 1, July 2025, p. 25638, https://doi.org/10.1038/s41598-025-11825-x.