Aislamiento de endófitos nuevos del filo Verrucomicrobia

Ana Juárez V blog journal club 12 junio, 2020 | 0

En las plantas terrestres, las raíces son el primer sitio en donde ocurren las interacciones con diversos microorganismos. La colonización de la raíz por parte de bacterias endófitas es un proceso activo que requiere de ciertas características y mecanismos moleculares. Para poder determinar estos mecanismos, se han hecho estudios reduccionistas en donde se han aislado bacterias. Sin embargo, dada la especialización hacia el nicho, son pocas las bacterias endófitas que se han logrado aislar y estudiar. Recientemente, se ha encontrado que el filo Verrucomicrobia se encuentra de manera abundante en la endósfera (hasta el 25 %), pero son muy pocos los estudios que se han hecho sobre este filo. Además, existe un sesgo en las colecciones actuales de bacterias endófitas del filo Verrucomicrobia, por lo que en este estudio se intentó aislar a Verrucomicrobias de rizomas de arroz Oryza sativa y O. longistaminata.

Para aislar a las Verrucomicrobias endófitas, se obtuvo un cultivo mixto de la endósfera y la superficie de la raíz (rizoplano). Después, se hicieron aislados y basados en el patrón de crecimiento, las características de la colonia y la morfología microscópica (cocos) se logró identificar a cuatro posibles Verrucomicrobias. A estas cepas las nombraron: LW23, ER46 y LR76 (estos tres aislados se obtuvieron del rizoplano) y EW11 (aislada de la endosfera). Para determinar las relaciones filogenéticas de los aislados se obtuvo la secuencia de 16s rRNA de las cepas y se llevaron a cabo análisis filogenéticos. Sus resultados muestran que algunas de las cepas aisladas, se agruparon con cepas que no se habían podido cultivar en el laboratorio (Figura 1). Además, dada la ubicación filogenética y la identidad de nucleótidos promedio (ANI) de los cuatro aislados, proponen que la cepa LW23 podría formar una nueva subdivisión dentro del filo Verrucomicrobia.

**Figura 1.** **Molecular phylogenetic (a), phylogenomic (b) and cell morphology (c) analysis of the novel Verrucomicrobia isolates.** (a) Molecular phylogeny based on based 16S rRNA gene sequences. Novel isolates of Verrucomicrobia in bold, putative novel subdivision 8 in purple. Almost complete 16S rRNA gene sequences were aligned with reference sequences from representatives of every subdivision of the phylum Verrucomicrobia. The evolutionary history was inferred by using the Maximum Likelihood method implemented in IQ-TREE. The percentage of trees in which the associated taxa clustered together is shown next to the branches. The tree is drawn to scale, with branch lengths measured in the number of substitutions per site. There were a total of 1228 positions in the final dataset, and Chlamydia trachomatis (NR 025888) was used as outgroup. (b) Phylogenomic relationships of Verrucomicrobia inferred by the whole-genome-based CVTree approach. Genomes or metagenomes covering all known subdivisions were selected, and novel isolates (purple) included. Analysis by CVTree3 with K = 6. (c) Cell morphology of strains EW11(1), ER46(2), LR76(3), and LW23(4). (A, B) Transmission electron micrographs of thin sections. (C, D) Images of cells stained with SYBR green to reveal condensed nucleic acids inside cells by Confocal Laser Scanning Microscopy. White arrowhead, electron-dense material. Scale bars indicate 500 nm (1–2 A + B, 3–4 B), 1000 nm (3–4 A) or 2 µm (C,D). Endospores were not observed. Specimen preparation through conventional fixation and dehydration lead to an irregular, scattered shape of some cells (2B) as described for other Verrucomicrobia

Se ha observado que las bacterias asociadas a la raíz pueden ocupar diferentes nichos: el suelo, la endosfera o el rizoplano, y por lo tanto muestran interacciones y adaptaciones genómicas diferentes que les permiten colonizar estos nichos. Para determinar la capacidad y patrones de colonización de los aislados, se usó un sistema de cultivo hidropónico de plantas de arroz. Los patrones de colonización fueron obtenidos utilizando microscopía con focal laser. La cepa LR76 colonizó el rizoplano, mientras que LW23 se ancló a las raíces y a los pelos radiculares formando agregados. La cepa ER46 colonizó levemente el rizoplano, mientras que la cepa EW11 se observó colonizando el rizoplano y la endosfera, en algunos casos formó biopelículas muy densas. Remarcablemente, en este estudio, se reporta esto como la primera prueba microscópica de colonización endofítica por organismos del filo Verrucomicrobia (Figura 2).

**Figura 2.** **Confocal Laser Scanning Microscopy of rice roots at 8 days post inoculation in hydroponic gnotobiotic culture.** Rice variety O. sativa ssp. japonica cv. Nipponbare, inoculated under gnotobiotic conditions and incubated for 7d. Roots were stained with SYBR Green to visualize bacteria. (a) Colonization of strain LR76, of strain LW23 (b,c), of strain EW11 (e,f), and of strain ER46 (d,g–j). Bars indicate 100μm (a), 50 μm (b–e,g,h) or 20 μm (f), respectively. Streaking of plant medium on RSA agar did not reveal any contamination. The non-inoculated control pants showed microscopically no bacterial colonization (Supplementary Fig. 1), and generally in this seed batch, intrinsic endophytes were not detected in any experiment.

Una vez que se validó que estas Verrucomicrobias aisladas pueden colonizar las raíces de las plantas ya sea como endófitos o colonizando sólo el rizoplano, los investigadores, obtuvieron los genomas en borrador de las cepas que aislaron. Dichos genomas borrador se compararon con otros genomas y metagenomas de bacterias que se sabe habitan la endosfera, el rizoplano y el suelo. Se incluyeron secuencias de los siguientes fila: Proteobacteria, Acidobacteria Gemmatimonadetes, entre otros. La comparación consistió en cuantificar la diversidad de los dominios de las familias de proteínas de los genomas usando la clasificación de Pfam. Los resultados de este análisis mostraron que el número de dominios diferentes fue más alto en los endófitos, seguido por los colonizadores del rizoplano y finalmente por los de suelo. Esto sugiere que existe un incremento en la complejidad de las funciones de las proteínas a medida que incrementa la interacción planta-microorganismo. Así mismo, el análisis de componentes principales de estos dominios confirmó la especialización del nicho, en donde se observa una separación entre los dominios Pfam de las endófitas, rizoplano y las bacterias de suelo. La relación funcional entre los organismos de la endosfera y el rizoplano fue mayor debido a que se observó una mayor intersección de sus dominios Pfam. En los endófitos, observaron un enriquecimiento en dominios que están relacionados a la movilidad por flagelos lo que fue confirmado por ensayos de swarming. Además, el metabolismo de los endófitos parece especializarse hacia las rutas que tienen que ver con el metabolismo de aminoácidos e hidrólisis de carbohidratos. También encontraron genes relacionados con el sistema de dos componentes, el cual parecen tener un papel importante durante la colonización; genes relacionados con la producción de ácido indol acético y fosfatasas (Figura 3). Finalmente, evaluaron el efecto de las 4 cepas de Verrucomicrobia sobre el crecimiento de la raíz de plantas de O. longistaminata, estos experimentos los llevan a cabo utilizando cultivos hidropónicos. Sus resultados muestran que las cepas ER46 (endofítica) y LR76 incrementaron significativamente el peso fresco de la raíz.

**Figura 3. Protein domains differentiating bacterial lifestyles in endophere, rhizoplane and soil across bacterial phyla**. Protein domains in (meta)genomes of well-established model organisms typically colonizing endosphere, rhizoplane or soil were compared. (a) Abundance of unique protein domains in (meta)genomes of bacteria from different compartments. Box-and-whisker plots for median (center lines), 25th and 75th percentiles (box edges), extreme data points (whiskers), and mean value (plus). Horizontal lines: statistical significance according to analysis of variance (ANOVA) followed by Holm-Sidak’s multiple comparison test, P ≤ 0.05 (*) or P ≤ 0.001 (***). **(b)** Between-group principal component analysis (bgPCA) of all Pfam protein domains in (meta)genomes of bacteria from the three compartments (P < 0.005 for all 3 pairwise comparisons according to PERMANOVA). **(c)** Venn diagram indicating differences and commonalities in Pfam domains of structural proteins encoded in the (meta)genomes from different compartments. The inner circle indicates the number of core protein families shared between all strains. The number of domains shared by all strains of one compartment are given in the outer circles (based on data from Supplementary Table S5). **(d)** Compartment signatures of protein domains. Examples of Pfam domains are given that are significantly enriched in (meta)genomes from endosphere or rhizoplane bacteria; for a given Pfam domain, bars are labelled by different letters if they are significantly different from each other at P < 0.05 using the Holm-Sidak method without assuming equal variance. Functions related to the respective domains are given below (Modificado de Bünger *et al*., 2020).

Referencia

Bünger, W., Jiang, X., Müller, J., Hurek, T., & Reinhold-Hurek, B. (2020). Novel cultivated endophytic Verrucomicrobia reveal deep-rooting traits of bacteria to associate with plants. Scientific reports, 10(1), 8692.

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