Entendiendo la dinámica de la comunidad para incrementar la optimización de la selección artificial de microbiomas.
La selección artificial de comunidades microbianas es una técnica poderosa y atractiva que se ha utilizado en muy pocos estudios. Posiblemente, esto se debe a la falta de éxito por una mala optimización del proceso. Por una parte, se sabe que las comunidades microbianas naturales son muy dinámicas y, por lo tanto, pasan por etapas distintas y rápidas de sucesión comunitaria. Sin embargo, poco se sabe sobre la dinámica de las comunidades que son seleccionadas de manera artificial. Así mismo, los mecanismos por los cuales ocurre la selección artificial dentro de la comunidad, la sucesión y, qué organismos son clave durante la selección artificial se desconocen. Por otra parte, se sabe, que las comunidades atraviesan distintas etapas de sucesión, donde se ven enriquecimientos de grupos de organismos los cuales pueden verse favorecidos porque desarrollan una función particular. Un buen ejemplo para estudiar los mecanismos involucrados en la selección artificial de comunidades es la degradación de quitina, puesto que se han caracterizado comunidades naturales y se entiende cómo ocurre la sucesión de organismos; además, se conocen las enzimas involucradas en el catabolismo de quitina. Se ha encontrado que, durante la degradación de la quitina, la sucesión ocurre de la siguiente forma: a) Se seleccionan los organismos colonizadores, b) se seleccionan los degradadores de quitina, c) están presentes los degradadores de quitina tramposos. Estos últimos, son organismos que no son metabólicamente capaces de llevar a cabo un proceso en particular por sí mismos, pero que pueden beneficiarse de los bienes públicos generados por otros. De manera interesante, se ha observado que, si la abundancia de los tramposos empieza a crecer demasiado, el acceso al recurso podría bloquearse por completo, lo que lleva a la pérdida de la función comunitaria y a pérdida de la estructura. En el medio ambiente se ha observado que el número de organismos capaces de absorber los subproductos de la hidrólisis de la quitina como el N -acetil- D-glucosamina (GlcNAc), es mucho mayor que el número que codifica para quitinasas. La estructura de la comunidad puede alterarse a través de cambios en la composición de las especies o interacciones entre organismos, lo que finalmente conduce a cambios en el fenotipo de la comunidad. En este estudio se centraron en tratar de determinar los mecanismos detrás de la selección artificial y de la sucesión temprana de una comunidad con la finalidad de optimizar la degradación de quitina. Dado que la quitina es el polímero más abundante en los ecosistemas marinos, constituye un componente clave en los ciclos oceánicos de carbono y nitrógeno y de ahí la importancia en los ecosistemas marinos.
El método que utilizaron fue el siguiente: Se inocularon 30 microcosmos con una comunidad natural proveniente de desechos marinos en Reino Unido, al final del periodo de incubación, se midió la actividad enzimática de la quitinasa por un ensayo con fluorescencia para cada microcosmos. Los microcosmos que presentaron la mayor actividad se seleccionan y se combinaron y se utilizan para inocular a próxima generación (Fig 1).
Fig 1. Method used for artificial selection of microbial communities. Briefly, 30 microcosms are inoculated with a natural community found in seawater (1). At the end of the incubation period, the enzymatic activity for a desired trait (e.g. chitinase activity) is measured for each microcosm (2). The three microcosms with the highest enzymatic activities are selected and pooled (3) and used to inoculate the next generation (4). This process is repeated over n generations (5).
El primer experimento de selección artificial consistió en la optimización del proceso, es decir se determinó en qué punto del experimento la actividad de quitinasa estaba en su punto máximo. Anteriormente vieron que este se alcanza a los 9 días. Por lo que todos los tiempos generacionales duran 9 días en incubación. Después de 14 transferencias, no se observó un aumento en la actividad, al contrario, en la transferencia 9 hubo una disminución. Cuando midieron la actividad de quitinasa entre la transferencia 14 a 15, observaron que el tiempo de incubación era importante, observaron que la actividad de quitinasa era buena durante los primeros 4 días y al día 9, la actividad decaía. Por lo que, hubo una reducción del tiempo de incubación. Con la reducción de los tiempos de incubación, se observó que la actividad de quitinasa aumentó en la transferencia 16 a 17. Sin embargo, este aumento se detuvo en la transferencia 18-19. La actividad se midió cada día y se encontró que en el día 2 se había observado una actividad de quitinasa nueve veces más alta. Lo que indicó que el tiempo de incubación se redujo. Aunque en el día 3 hubo un aumento en la biomasa. Para la selección por quitina, se observó una mayor actividad reduciendo los tiempos, sugiriendo que, en este caso, la selección por degradación de quitina se acorta no solo para alcanzar la actividad máxima de quitinasa si no para entrar en descomposición debido a la sucesión de la comunidad (Fig 2).
Fig 2. Chitinase activity in artificial selection experiment 1. a Enzymatic activity measured over 20 generations. Each point represents the mean of the positive selection communities (n = 30) from which the mean of the randomly selected controls (n = 30) was subtracted. The black dotted line (zero) represents where chitinase activity of the positive selection is equal to that of the random selection. b Chitinase activity measured within the incubation period of generation 15 of the 9-day incubation. c Chitinase activity and DNA concentration of the positive selection measured within the incubation period of generation 20 of the 4-day incubation. Each point in panels b and c represents absolute chitinase activity measured in the positive (red) and random selection (blue). Arrows in panel a indicate the generations in which the regular monitoring of chitinase activity was performed, i.e. shown in panels b and c.
Para caracterizar la sucesión de la comunidad utilizaron la secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA y 18S. Secuenciaron la comunidad inóculo de cada una de las 20 transferencias a los 4 días y a los 9 días de incubación. Los datos fueron analizados utilizando DADA2 y así se obtuvieron los ASVs (Variantes de secuencia de amplicones). Se observó que en la transferencia 20 hubo un aumento de la diversidad procariota, mientras que la eucariota disminuyó. Además, se buscó analizar cuáles fueron los 5 principales ASVs que contribuyeron a la variación. Así los ASVs más importantes fueron: Thalassotalea, Cellvibrionaceae (Gamma-proteobacteria), Crocinitomix Terasakiella , Spirochaeta, estos ASVs fueron los más abundantes al día 2, lo que sugiere que pueden ser los impulsores principales de la hidrólisis de quitina. Esto estuvo en concordancia con los resultados de los aislados microbianos, en donde se confirmó que las gamma-proteobacteria son los principales contribuyentes de la degradación de la quitina. También usando el 18S rRNA se logró identificar a los 5 AVSs que más contribuyeron a la variación dentro de la comunidad los cuales son: Cafeteria sp, Paraphysomonas , Cafeteria sp. Apsidica, Incertae Sedis. Estos grupos eucariotas también mostraron una gran variación entre el comienzo y el final del periodo de incubación (Fig 3).
Fig 3. Daily microbial community analysis over the 4-day incubation period within generation 20. The analysis was performed on the three communities that showed highest chitinase activity by the end of the 4 days and which would have been used to inoculate the next generation. a Simpson’s index of diversity of the 16S (left) and 18S rRNA gene (right) amplicon analysis. The scale ranges between 0.38 (low) and 0.93 (high). b Community relative abundance over the 4-day incubation period. Only ASVs with abundance above 1% in at least one time point are shown. The abundance for each ASV is a mean value from the three communities. ASVs were classified to genus level using the SILVA database (v132). Names in brackets were not identifiable with the standard analysis pipeline and were identified through a BLAST search of the NCBI database. c Five 16S and 18S rRNA gene ASVs that contributed the most to the community variations over time according to a SIMPER analysis. The percentage of variation to which each ASV contributes is indicated. Error bars represent the standard deviations of the three communities used to inoculate the next generation
Para determinar la presencia del gen de la quitinasa en las muestras, generaron los metagenomas artificiales, usando PICRUST a partir de las secuencias del 16s rRNA y con esto buscaron las enzimas que están involucradas en la degradación de quitina. En el experimento en donde sólo se incubaron durante 4 días los microcosmos, se encontró que el gen de quitinasa (K01183) estaba presente y había hasta 30 veces más copias de éste en comparación con el experimento de 9 días. Estos genes se detectaron en Gamma-proteobacteria y algunas Bacteroidia, mientras que los genes de quitina desacetilasa fueron exclusivos de alfa-proteobacteria. Aquí los autores resaltan la importancia de tomarse estos datos con precaución, ya que sólo son predicciones, sin embargo, las predicciones coinciden con los datos.
Al final del experimento se obtuvieron 50 aislados bacterianos, de acuerdo con las secuencias de 16s, 20 fueron únicos, de estos, 18 mostraron al menos un 98% de similitud con uno a más ASVs. Sin embargo, ninguno de estos pertenecía a los ASVs más abundantes. Se evaluó la capacidad de degradar quitina de los aislados y se encontró que 16 aislados fueron capaces de degradar quitina, así mismo 16 podían crecer utilizando como única fuente de carbono a GlcNAc, y sólo 11 de estos podía crecer en presencia de quitina cómo única fuente de carbono. Todos estos aislados fueron gamma-proteobacterias, y estos fueron capaces de degradar quitina. Así llegan a la conclusión que un tramposo, es decir aquel que puede crecer en GlcNAc pero no quitina, solo puede crecer en presencia de uno que si puede crecer en quitina.
Finalmente, este es un ejemplo de cómo la selección artificial de comunidades puede mejorarse en gran medida controlando los tiempos de incubación entre transferencias. Por lo que se propone que las transferencias deben realizarse en el pico de la actividad deseada o estas se remplazan rápidamente por comunidades menos eficientes, llenas de organismos tramposos. Por lo que se sugiere que experimentos futuros de selección artificial deberían ajustar los tiempos de incubación de transferencia a los máximos de actividad para desarrollar con éxito los fenotipos deseados.
Referencia
Wright, R. J., Gibson, M. I., & Christie-Oleza, J. A. (2019). Understanding microbial community dynamics to improve optimal microbiome selection. Microbiome, 7(1), 85.
