3 de abril: Defining bacterial species in the genomic era: insights from the genus Acinetobacter
Chan, J., & Halachev, M. (2012). Defining bacterial species in the genomic era: insights from the genus Acinetobacter. BMC microbiology, 0(758), 3–11. Retrieved from http://www.biomedcentral.com/1471-2180/12/302/
Abstract
Background
Microbial taxonomy remains a conservative discipline, relying on phenotypic information derived from growth in pure culture and techniques that are time-consuming and difficult to standardize, particularly when compared to the ease of modern high-throughput genome sequencing. Here, drawing on the genus Acinetobacter as a test case, we examine whether bacterial taxonomy could abandon phenotypic approaches and DNA-DNA hybridization and, instead, rely exclusively on analyses of genome sequence data.
Results
In pursuit of this goal, we generated a set of thirteen new draft genome sequences, representing ten species, combined them with other publically available genome sequences and analyzed these 38 strains belonging to the genus. We found that analyses based on 16S rRNA gene sequences were not capable of delineating accepted species. However, a core genome phylogenetic tree proved consistent with the currently accepted taxonomy of the genus, while also identifying three misclassifications of strains in collections or databases. Among rapid distance-based methods, we found average-nucleotide identity (ANI) analyses delivered results consistent with traditional and phylogenetic classifications, whereas gene content based approaches appear to be too strongly influenced by the effects of horizontal gene transfer to agree with previously accepted species.
Conclusion
We believe a combination of core genome phylogenetic analysis and ANI provides an appropriate method for bacterial species delineation, whereby bacterial species are defined as monophyletic groups of isolates with genomes that exhibit at least 95% pair-wise ANI. The proposed method is backwards compatible; it provides a scalable and uniform approach that works for both culturable and non-culturable species; is faster and cheaper than traditional taxonomic methods; is easily replicable and transferable among research institutions; and lastly, falls in line with Darwin’s vision of classification becoming, as far as is possible, genealogical.
Keywords:
Genome-based taxonomy; Bacteria; Sequence-based analysis; Whole-genome data
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El objetivo de este trabajo es analizar la posibilidad de abandonar los métodos tradicionales de clasificación taxonómica en bacterias tales como la hibridación DNA-DNA y confiar únicamente en los análisis de secuencias genómicas. Para esto tomaron como base al género Acinetobacter del cual se secuenciaron trece nuevos genomas y se analizaron junt con genomas previamente secuenciados.
Al igual que en los artículos de Cohan y Barraclough se discute que el análisis taxonómico tradicional empleado en plantas y animales no puede ser aplicado en los microorganismos, lo cual dio origen a un nuevo tipo de aproximaciones teniendo a la hibridación DNA-DNA como la regla dorada, sin embargo con el desarrollo y optimización de los métodos de secuenciación se ha dado el desarrollo de nuevos estándares para la clasificación taxonómica tal como la identidad promedio nucleotídica (ANI), donde se ha observado que un valor > 95% corresponde aproximadamente al valor empleado de 70% para la hibridación. Estos métodos sin embargo se sabe que no son infalibles pues para uno de los genes más empleados, el 16S rRNA se ha visto que no llega a considerar toda la divergencia entre dos cepas.
En este trabajo se comenzó por analizar la identidad a nivel del 16S para el género Acinetobacter, pero como se mencionó anteriormente se encontraron algunas inconsistencias principalmente al sugerir que dos especies descritas como distintas deberían ser la misma, este problema como mencionan los autores está dado por el valor de corte establecido tradicionalmente.
Para eliminar el sesgo generado al analizar un solo gen, los autores decidieron analizar un subgrupo de 127 genes de los denominados genes core. Con la reconstrucción filogenética del género empleando este conjunto de genes, se generó un árbol que soporta el status conocido de la especie a excepción de tres especies, dos de las cuales mencionan los autores pudieron deberse a un error en la clasificación de su colección.
En lo que respecta al análisis bioinformático de las secuencias, se realizaron tres tipos de análisis, el ANI que se basa en la identificación de fragmentos alineables en pares de secuencias, la aproximación de la K¬-string que toma en cuenta el contenido de oligopéptidos en análisis proteómicos y la “fluidez del genoma” que proporciona una medida en cuanto a la diferencia entre los genomas evaluados a nivel de genes. De estas tres aproximaciones se encontró que los análisis tipo ANI concuerdan con los métodos tradicionales y filogenéticos de clasificación, mientras que los otros dos se encuentran fuertemente influenciados por eventos de transferencia horizontal.
En base a estos análisis se encontró que si bien los análisis filogenéticos basados únicamente en el gen 16S rRNA proporciona resultados que pueden llegar a ser no del todo informativos, la combinación de los denominados genes core junto con análisis del tipo ANI, proporcionan un método bastante confiable para la clasificación de especies. A mi parecer este tipo de aproximaciones para clasificar especies será eventualmente uno de los principales mecanismos de clasificación pues el avance en las técnicas de secuenciación y análisis permiten una rápida identificación y caracterización con un alto grado de confiabilidad tal como se mostró aquí.
El trabajo de Chan y colaboradores, representa un claro ejemplo de como la aplicación correcta de la información genomica, puede ser suficientemente robusta para definir especies bacterianas, sin tomar en cuenta los criterios convencionales de clasificación. En su trabajo, utilizan el género Acinetobacter como “caso prueba” para evaluar la robustes de dos acercamientos genómicos: 1) filogenias basadas en secuencias de genes únicos y múltiples, y 2) comparaciones de contenido génico: “K-string” (basado en análisis de contenido oligo-peptídico de proteomas predichos) y fluidez genómica (el cual proporciona una medida de disimilitud de genomas evaluados a nivel génico). Como parte de sus resultados en primer lugar, encuentran que especies identificadas anteriormente por medio de 16S, tienen valores de similitud mayores a 99%, por lo que evidencian los problemas de este criterio para la delimitación de especies bacterianas. Por otra parte, obtienen que los acercamientos de K-string y fluidez genómica, no son consistentes con las filogenias predichas anteriormente, ya q parecen estar fuertemente influenciados por efectos de HGT. Sin embargo, obtuvieron una fuerte congruencia en el árbol filogenético y dendograma (basado en el porcentaje de identidad de nucleótidos) entre cada uno y las filogenías predichas anteriormente, demostrando así que la tecnica puede ser apto para delimitar las especies bacterianas en ausencia de los datos fenotípicos. En conclusión, en este trabajo se demuestra que la combinación de análisis filogenéticos basados en el core-genoma y el porcentaje ANI, son un método factible para delimitar especies bacterianas, como lo demuestran con el genero Acinetobacter. Lo que hace tan informativo y robusto a este acercamiento, es que está basado en una filogenia del core-genoma, la cual a su vez está basada en todas las secuencias codificantes compartidas, y el porcentaje de identidad de nucleótidos,el cual proporciona una muy buena resulución en especies y subespecies
Lo único rescatable del artículo es que secuenciaron 13 genomas nuevos de Acinetobacter y aunque son borradores (no terminados) tal vez le sirvan a alguien. No describen nada sobre las características de los genomas obtenidos, ni sobre la comparación entre ellos, nada de los genes, nada de sus funciones o del contenido, nada en realidad que sea muy relevante. Lo poco que mencionan tampoco lo discuten. Lo único importante que mencionan es que las filogenias que construyeron con métodos genómicos les permitió colocar correctamente dos especies mal ubicadas. Su discusión sobre el concepto de especie en bacterias dado lo que se sabe es muy pobre. Y lo peor es que en general el artículo es bastante aburrido, por ejemplo aparentemente describen 5 genomas de los 13 (su descripción no tiene mucho sentido) y en realidad no dicen mucho sobre los genomas. Además en general sus conclusiones son cosas que ya se sabe, que con más detalle se han revisado en otros artículos.
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Defining bacterial species in the genomic era: insights from the genus Acinetobacter Chan J. et al (2012). Defining bacterial species in the genomic era: insights from the genus Acinetobacter.BMC Microbiology 12(302)
Si bien sabemos se han establecido estándares que aparentemente delimitan unidades discretas o especies bacterianas, se ha visto en este artículo que el solo estudio de secuencias del gen de 16S rRNA o de análisis múltilocus son poco confiables y poco informativos, como el caso que se analizó con Acinetobacter. En contraste se observó que un estudio de comparación de genomas completos es mucho más robusto e informativo. Es de gran ayuda el apoyo en los métodos métricos en el estudio de comparación de genomas completos de organismos de éste género para la delimitación de especies. Este enfoque es muy atractivo, sin embargo nos remitimos a la disponibilidad de genomas completos secuenciados, y alejémonos más, nos remontamos a las limitaciones de nuestros métodos de cultivo en laboratorio y a que los estudios genómicos comparativos solo se pueden llevar a cabo con esa pequeña proporción de organismos que somos capaces de recuperar en aislados.
En este artículo, buscan definir el concepto de especie a partir del análisis de genomas, yendo en contra de los análisis tradicionales en donde usan aproximaciones fenotípicas o resultados de análisis por hibridación DNA-DNA, esto lo hacen con el propósito de pulir las técnicas o lograr una mejor especificidad en cuanto a la determinación de las especies, ya que por el método de secuencia del rRNA 16S, no provee de la robustez suficiente ni de la confiabilidad esperada, esto se debe a la gran cantidad de eventos de transferencia horizontal que se presentan.
Los autores concluyen que es importante hacer una combinación entre los análisis filogenéticos, y los análisis de identidad nucleotídica, para determinar grupos monofiléticos en las bacterias.
Utilizando el gen 16S ribosomal es como actualmente se definen las especies bacterianas, sin embargo es un criterio que a los ojos de los autores no permite delinear especies esto simplemente por la naturaleza del gen (i.e. es muy conservado). Por lo que se propone en este articulo el uso de genomas completos y medidas como el ANI (average nucleotide identity ) para delimitar las unidades.
Para este estudio se secuenciaron varios genomas del genero Acinetobacter (cobertura entre 8 y 24X) y junto con los genomas disponibles en la red se construyo una filogenia utilizando los genes del “core”, esta se contrasto con otras obtenidas por métodos distintos como el 16S. La filogenia del gen 16S agrupo aislados distintos (A. calcoaceticus y A. lwoffiis) lo que demuestra que no es un buen marcador cuando se trata de miembros cercanos. Se observo que estrategias como el K-string y genome fluidity tienen desventajas importantes pues son medidas influenciadas por la transferencia horizontal.
Así que los autores proponen el uso del ANI para hacer las interpretaciones filogenéticas, puesto que en sus resultados observan el mismo comportamiento utilizando los genes del “core”.
Finalmente, se sabe que el gen 16S como marcador taxonómico no tiene la resolución suficiente para diferenciar dos cepas cercanas pero tiene la ventaja de ser un método practico que te permite tener una primera aproximación, hoy es posible utilizar la información proveniente de los genomas para hacer inferencias más robustas y conforme se avance en los esfuerzos de secuenciación será más fácil entender ¿Qué es una especie?.
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