Análisis de la diversidad microbiana y búsqueda de nuevas enzimas con actividad de xilanasas en sedimentos de aguas termales en España.
Los xilanos son el segundo grupo más abundante de polisacáridos en la naturaleza, forman parte de la pared celular de las plantas. Las enzimas xilanasas, catalizan la ruptura de los xilanos. Estas enzimas se encuentran presentes en bacterias, plantas e insectos. Además, se ha encontrado que existen otras enzimas como las glicósido hidrolasas (GH) que también tienen actividad de xilanasas, e interesantemente, muchas de éstas son termoestables. Estas xilanasas que son termoestables han sido ampliamente utilizadas en la industria por sus aplicaciones en la producción de: alimentos, papel, textiles y biocombustibles. Una buena fuente para buscar nuevas xilanasas termoestables son las aguas termales y dado que muchas bacterias de este tipo de ambientes no pueden ser cultivadas en el laboratorio, la metagenómica es de gran ayuda porque permite obtener secuencias de proteínas de interés independientemente de nuestra inhabilidad para cultivar a las bacterias.
Galia, una región al norte de España, cuenta con varios sitios de aguas termales. Por lo que, en este estudio Kamila Knapik y colaboradores de la universidad de Coruña, decidieron muestrear esta región para describir la diversidad taxonómica de bacterias y encontrar nuevas enzimas con actividad de xilanasas a partir de datos metagenómicos. Primero, colectaron sedimento de las aguas termales, determinaron parámetros como la temperatura y pH. Después, secuenciaron el DNA total usando illumina Hiseq. Para el procesamiento de datos, específicamente, la anotación de funciones, usaron Blastx DIAMOND contra la base de datos pública de proteínas del Centro Nacional para la Información Biotecnológica, NCBI. Para analizar la taxonomía, exportaron sus datos a MEGAN. Posteriormente, identificaron a las posibles GH, usando la base de datos CAZy. Para poder recuperar a las proteínas de interés, diseñaron una biblioteca del DNA total mediante fósmidos. La biblioteca fue utilizada para transformar células y posteriormente, seleccionaron aquellas secuencias con actividad de xilanasas. Secuenciaron a los posibles candidatos e identificaron que efectivamente uno tuvo una actividad de xilanasa. Después, clonaron, expresaron y purificaron a esta proteína y determinaron la actividad de xilanasa con diferentes sustratos, además, midieron el efecto de los metales sobre la actividad de la enzima y finalmente, construyen un modelo por homología de esta enzima.
Sus resultados muestran que el pH del sedimento fue de 5.9, mientras que el pH del agua es de 8.2, y la temperatura del agua fue de 76°C. Con respecto a la clasificación taxonómica de la comunidad del sedimento, encuentran que las bacterias son más abundantes en un 93% en comparación con las Arqueas 7%, y que el filo Acidobacteria fue el más abundante (25%), mientras que Chloroflexi (20%) fue el segundo, estos resultados coinciden con estudios previos de metagenomas de sedimentos termales (Figura 1).
Figura 1. Krona chart representation of taxonomic classification of the hot spring sediment metagenome.
De la biblioteca de fósmidos, encuentran 23 posibles secuencias que codifican para GH. Sin embargo, del ensayo que hicieron detectan 52 clonas positivas para la actividad de xilanasa. De estas encuentran que una asignada como XynA3 tiene una identidad de secuencia del 92% con una xilanasa de Paenibacillaceae bacterium que se aisló de metagenomas de composta. Al hacer un alineamiento entre estas dos proteínas encuentran que hay algunas diferencias sutiles en ciertos residuos relacionados con su posible adaptación a un pH ácido. Una vez que obtuvieron a la enzima XynA3 soluble, la analizaron y encontraron que esta proteína fue estable a temperaturas de más de 70°C y menos de 80°C (Figura 2).
Probaron diferentes metales para determinar si podían aumentar la actividad de la enzima y encontraron que la adición de FeCl3 y beta-mercaptoetanol tienen un efecto positivo en la actividad. Así mismo, la madera fue el sustrato que usa esta enzima por lo que puede ser usada en la industria en los procesos de blanqueamiento de papel. Finalmente, este es un claro ejemplo del uso de la metagenómica para descubrir nuevas enzimas estables y con funciones deseadas.
REFERENCIA
Knapik, K., Becerra, M. & González-Siso, M. Microbial diversity analysis and screening for novel xylanase enzymes from the sediment of the Lobios Hot Spring in Spain. Sci Rep 9, 11195 (2019).
