El precio de tener pares de bases sintéticos

Zhang y compañía continúan en su búsqueda para diseñar un organismo viable que contenga pares de bases sintéticos (PBSs). Estos pares X-Y están compuestos por dNaM-d5SICS o  dNaM-dTPT3, los cuales no forman puentes de hidrógeno (como los pares A-T o G-C) sino que se asocian por interacciones hidrofóbicas. En una publicación previa se reportó la incorporación de un plásmido con un locus X-Y y su replicación exitosa, además de la incorporación de un factor de importe para estos nuevos nucleótidos, sin embargo este organismo creció pobremente y el plásmido con este par sintético se perdió tras algunas generaciones. En esta publicación se reporta un diseño en Escherichia coli que permite el crecimiento estable del organismo portador y la conservación de los componentes genéticos que contienen PBSs a lo largo del tiempo. Las estrategias utilizadas para mejorar el crecimiento de la bacteria con respecto a la expresión del transportador de nucleótidos fueron el uso del promotor lacUV5, la incorporación del gen codificante al cromosoma, optimización del uso de codones y la eliminación del péptido señal (ya que el transportador pertenece originalmente a un alga). Ahora que E. coli crecía de manera robusta, se buscó la manera de conservar los PBSs contenidos en plásmidos. Esto se resolvió utilizando la endonucleasa Cas9 del sistema CRISPR-Cas y RNA guías (sgRNA) que dirigieran la actividad endonucleasa hacia plásmidos que tuvieran el PBS mutado como resultado de una sustitución. Se identificaron algunas combinaciones problemáticas de nucleótidos naturales que redujeron la retención del PBS si se encontraban flanqueándolo como d(C-NaM-C), d(C-NaM-A) y d(C-NaM-G). Finalmente se construyó un plásmido que contenía el sgRNA diseñado y dos PBS, uno en la posición 453 de la hebra con sentido del gen para la GFP y en la posición 36 de la hebra con sentido del gen tRNA SerT. Dos cepas de E. coli, una con expresión de Cas9 y otra sin ella, fueron transformadas con este plásmido y se encontró una reducción del 17% de la tasa de crecimiento y una retención casi completa de los dos PBSs, lo cual representa avances significativos con respecto al trabajo anterior.

Zhang Y., Lamb B. M., Feldman A. W., Zhou A. X., Lavergne T., Li L., & Romesberg F. E. (2017). A semisynthetic organism engineered for the stable expansion of the genetic alphabet. PNAS, 10.1073/pnas.1616443114.