Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population
Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J. & Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature 489, 513–8 (2012).
Evolutionary novelties have been important in the history of life, but their origins are usually difficult to examine in detail. We previously described the evolution of a novel trait, aerobic citrate utilization (Cit1), in an experimental population of Escherichia coli. Here we analyse genome sequences to investigate the history and genetic basis of this
trait. At least three distinct clades coexisted for more than 10,000 generations before its emergence. The Cit 1 trait originated in one clade by a tandem duplication that captured an aerobically expressed promoter for the expression of a previously silent citrate transporter. The clades varied in their propensity to evolve this novel trait, although genotypes able to do so existed in all three clades, implying that multiple potentiating mutations arose during the population’s history. Our findings illustrate the importance of promoter capture and altered gene regulation in mediating the exaptation events that often underlie evolutionary innovations.
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Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population
A pesar de que es ampliamente reconocido que E. coli no puede explotar el citrato en condiciones aeróbicas, y solo está limitada a la existencia de glucosa en su medio de cultivo. Mediante un experimento de 12 cepas monoclonales de E. coli durante más de 40,000 generaciones en un medio mínimo de glucosa, logró registrar mutaciones innovadoras que abrían nuevas oportunidades ecológicas a ciertas cepas. La aparición de cepas Cit +, capaces de usar él citrato, fue debido a una variante evolutiva dentro de una población y para la generación numero 31,000 comenzó a ser dominante y a doblar su tamaño de población.
Debido a este hallazgo, se refuerza que las novedades evolutivas son cuantitativamente nuevas cepas que abren oportunidades ecológicas, y que promueven la diversificación. Para poder hallar la historia del origen de esta cepa nueva y distinguir entre dos hipótesis A) mutación puntual o B) Epistasis, secuenciaron 29 clonas en varias generaciones, entre estas fueron 9 Cit+, y 3 potenciales de Cit-. La secuenciación mostro mutaciones como deleciones, substituciones, SNPs, re-arreglos cromosomales. Mediante la historia filogenética de las poblaciones fueron polimórficas. Varias clados presentaron múltiples clones, siendo los clados que perduraron a través de la evolución de Cit+ y coexistieron; C1, C2 y C3. A pesar de que la presencia de clones Cit + surgió por la generación 20,000 no fue hasta la generación 31,000 donde las primeras células Cit+ aparecieron.
Los tres procesos involucrados en la evolución de Cit+ son, potencializadas; la evolución del esqueleto génico que permite que la nueva función sea accesible por mutación. Actualización; cuando la cepa emerge en la generación 31, 500 aunque sea una variante muy débil. Refinamiento; la nueva función es refinada para un eficiente explotación del citrato, hasta el punto en donde es dominante.
Para que E. coli pudiera ser capaz de utilizar el citrato del medio requería de la expresión de un transportador de citrato, que esta correlacionado con el hallazgo en la secuencia de los linajes de Cit+, de la presencia del gen rnk y citT, que codifican para un amplio espectro en funciones de fermentación para citrato/succinato. Este segmento que contenían a los genes mencionados no se hallaba ni en la cepa ancestral ni en la cepa Cit-. La probable expresión del citT es debido al módulo de rnk-citT durante el metabolismo aerobico, debido a que citT permanece silencioso en condiciones de oxígeno y es necesario el promotor rnk para su expresión.
La capacidad e aumentar las clonas de Cit+ fue la generación de copias que había de cit, donde la modulación de rnk-citT con el paso de las generaciones aumentaron la expresión de citT, que permitió su expansión del fenotipo Cit+.
Para corroborar si la causa del éxito de este nueva cepa era por interacciones de epistasis, movieron el modulo, rnk-cit, por medio de plásmidos al clon ancestral, y C1, C2 y C3. Para las 4 cepas lograron crecer en el medio de citrato. Sin embargo, la C1 y C2 y la ancestral lo hicieron de manera lenta y poco abundante, mientras que el clon C3, creció mucho más rápido y extensivamente, demostrando que había interacciones epistaticas entre el modulo y las mutaciones propias del esqueleto.
Los mutantes de Cit + surgieron a partir de diversos procesos mutacionales y no solo de uno, que reclutaban diferente promotores que permitían la expresión de citT, durante el metabolismo aérobico.
Durante el curso de la evolución, la duplicación génica, divergencia de secuencias y recombinación génica, han sido las fuentes principales para la generación de novedades funcionales o novedades evolutivas. Actualmente, existe una gran cantidad de estudios detallados en investigar el papel de cada uno de estos procesos para la generación de proteínas con nuevas funciones, aplicadas principalmente a procesos biotecnológicos o industriales. Sin embargo el estudiar detalladamente a nivel molecular el origen de una nueva función en un microorganismo, no había sido posible hasta el experimento a largo plazo de Lenski y colaboradores iniciado hace 25 años. En el 2008 publicaron el reporte de una nueva variante de E.coli capaz de alimentarse de citrato, lo cual no es común en E.coli, de hecho, una de las características de este microorganismo modelo, es su incapacidad de asimilar este compuesto en presencia de oxígeno, y hasta donde yo he leído, no conozco ningún otro reporte de una E.coli (sin transformar genéticamente) capaz de asimilar el citrato en condiciones oxícas. En el 2012 llevan el estudio a nivel genético y molecular, para investigar detalladamente el origen de esta nueva función en el E.coli, la cual según reportan, se basa en una duplicación ocurrida en el gen citT. En condiciones anóxicas, se enciende este gen para permitir la entrada de citrato que se utiliza como fuente de energía en contraparte, en condiciones óxicas, este gen no se transcribe ya que existen otras fuentes más favorables para la obtención de energía (glucosa). Ahora bien, para que este gen se encienda o permanezca apagado, tiene que estar cerca de un promotor que lleve a cabo el “swich” dependiendo de las condiciones del medio. Durante el curso del experimento, en una población ocurrio una duplicación del gen citT, y al ocurrir esto, la nueva copia termino cerca de un promotor (rnK) que enciende los genes próximos en condiciones óxicas. Según lo demuestra Blount, esta mutación ocurrió aproximadamente en la generación 31500, donde encontró unas variantes que se podían alimentar de citrato pero no muy eficientemente, ya que necesitaban glucosa en el medio para poder sobrevivir. Conforme fueron avanzando las generaciones, se llevó a cabo refinamiento de la función adquirida, sin embargo tal y como lo demuestra Blount y colaboradores, fue necesario que las bacterias acumularan mutaciones y adquirir un fondo genético para poder sobrellevar la duplicación del gen citT-cerca del promotor rnk (rnk-citT). En otras palabras, las bacterias de generaciones anteriores a la 31500, que fueron transformadas con el módulo rnk-cit3, no llevaban a cabo la nueva función. Ahora bien, las generaciones posteriores a 31500, refinaron la función ya que pudieron replicar y hacer extra copias del módulo rnk-cit3, y con esto mejorar su crecimiento en citrato. Es por eso que los autores sugieren que el adquirir esta novedad evolutiva, se llevó a cabo en tres etapas 1) Potenciación 2) Actualización y 3) Refinamiento: 1(Fenotipo inicial> mutaciones adicionales)>> 2(nueva función)>> 3(refinamiento de la nueva función> fijación de la mutación en la población. Todo este trabajo lo pudieron llevar a cabo con ayuda de la mejora en las técnicas de secuenciación, la genómica comparativa y su las cepas preservadas en cada generación que sirven como su registro fósil, y con lo cual han podido reconstruir a detalle la historia de la población a un nivel nunca antes estudiado.
¿Cómo se examina el origen de una novedad evolutiva? Más aún, cómo se hará esto a nivel molecular!!
Aquí se analiza la secuencia del genoma de 29 clones de E. coli para investigar la historia y las bases genéticas de un carácter novedoso (uso aeróbico del citrato, Cit+). Las poblaciones de E. coli que se usaron han sido propagadas durante 40,000 generaciones.
Se hicieron reconstrucciones filogenéticas a partir de matrices de presencia-ausencia de todas las mutaciones identificadas en las secuencias de los genomas. Antes de que este carácter apareciera, coexistieron tres clados distintos durante más de 10,000 generaciones (fig. 1).
El carácter Cit+ se originó en una duplicación en tandem que capturó un promotor aeróbico para la expresión previa de un transportador del citrato.
Se destaca que la evolución del carácter Cit+ involucra tres procesos sucesivos: potenciación, actualización y refinamiento.
Al describir estos tres procesos, se destaca que la duplicación de genes ha tenido un rol determinante y creativo al generar redundancias que permiten nuevas funciones. Hay una cierta capacidad en las duplicaciones para producir nuevas funciones por medio de eventos de captura de promotores que cambian las redes de regulación. Por último, una novedad evolutiva funcional, con frecuencia emerge en forma rudimentaria que debe ser refinada para explotar las oportunidades ecológicas.
El artículo es un reporte de un experimento de evolución dirigida en donde se hizo crecer una población experimental de E. coli en un sustrato de glucosa por 40,000 generaciones. Una línea de crecimiento evolucionó una adaptación crucial al uso de citrato. Este tipo de mutación es extremadamente rara y surgió aproximadamente cuando iban 31,000 generaciones. La reconstrucción filogenética se puede dar con la ayuda de cepas congeladas cada cierto tiempo, lo cual, aunado a la secuenciación, permite dar cuenta de la historia evolutiva concreta de cada una de los cambios que llevaron a la aparición de este caracter.
La evolución de la capacidad de usar el citrato se dió en 3 pasos. En el primero, se acumularon algunas mutaciones que posteriormente iban a ser cruciales para el desarrollo total del caracter. Esta fase de potenciación, como le llaman, es interesante, pues requiere de 1) cambios que por efectos epistáticos podrían haber llevado a las células a ser más vulnerables a los cambios posteriores de la adquisición de la capacidad de comer citrato. Un ejemplo es una mutación en el gen arcB, que codifica para una kinasa que interviene en el metabolismo de los ácidos tricarboxílicos. Al remover esta función, la utilización de citrato podría proceder más eficientemente. Otra posibilidad es que cambios físicos en la organización de los genes dentro del genoma potencíe a la célula a la adquisición de los genes dentro del operón involucrado. Sin embargo, no se obtuvo evidencia concluyente de que ninguno de estos dos procesos haya sido el más importante. Después de estos cambios, los más importantes involucran la duplicación de genes asociados al operón que permite el metabolismo del citrato, debido a la aparición de una pieza fundamental, un transportador de citrato, que es un elemento faltante en aquellas cèlulas de E. coli que no pueden metabolizar este compuesto. La última etapa comprende el refinamiento de los genes que aparecieron en la segunda etapa, que permiten captar el citrato. Esto pasó por cambios como la adición de un elemento de inserción y la aparición de dos SNP’s, uno de los cuales es el cambio importante, pues aumenta la eficiencia del recambio de succinato por citrato, que es la forma en que funciona el transportador. En conclusión, además de los cambios no bien discernidos en la potenciación, los cambios más importantes fueron dentro del operón: duplicaciones que permiten la aparición de un transportador. Esto nos habla de la importancia de la duplicación de unidades funcionales como la base de donde provienen los bloques de construcción de las adaptaciones evolutivas.
La incapacidad para crecer en citrato aeróbicamente es una característica de la bacteria Escherichia coli, estudios anteriores encontraron mutantes espontáneas que eran capaces de utilizar al citrato como fuente de carbono y energía. Este cambio es una característica que surge como resultado de la evolución y que le brinda a los organismos oportunidades ecológicas que a su vez promueven la diversificación.
El objetivo de este trabajo fue evaluar como fue que se dio esta evolución y mediante qué procesos las bacterias adquirieron la capacidad de crecer en citrato. Los autores aprovecharon que contaban con una librería congelada de clonas de E. coli de diferentes generaciones y que su estudio previo había implicado más de 40,000 generaciones con lo que fueron capaces de re-visitar la historia y construir filogenias a partir de análisis de mutaciones y de secuencias.
Al replantearse la evolución en la historia de las bacterias, los autores notaron que aquellas clonas que fueron aisladas en generaciones posteriores tenían una mayor probabilidad de producir mutantes Cit+ que aquellas más ancestrales, esto implica que la evolución de un fondo genético potencializó el surgimiento de sta característica en las generaciones posteriores. Estos cambios podrían haber sido por diferentes procesos como el cambio de dominios, la alteración en la regulaciónm y la duplicación seguida de la adquisición de nuevas funciones. Se plantean dos posibles mecanismos: uno en el que la tasa de mutación cambia y otro en el que existe una interacción epistática de forma tal que la expresión de una mutación Cit+ requiere una o más mutaciones previas.
El análisis mostró la existencia de al menos tres clados distintos que coexistieron por más de 10,00 generaciones antes del surgimiento de la mutación Cit+. Esta característica se originó en uno de los clados como resultado de la duplicación en tandem de un promotor de un transportador de citrato que se expresa en condiciones aeróbicas. La propensión a desarrollar esta nueva característica fue variante entre los clados aunque el genotipo necesario estaba presente en todos ellos lo que implica que surgieron múltiples mutaciones potencializadoras en la historia de las bacterias.
Las ventajas que confiere utilizar a E.coli como modelo experimental para la evolución de características novedosas permitieron llevar a cabo estudios comparativos que muestran la importancia de la duplicación de genes en la evolución al generar redundancia y posible neo-funcionalización. Otro aspecto importante y menos estudiado es cómo la duplicación puede producir nuevas funciones a partir de la captura de promotores, lo que ocasiona cambios en las redes de regulación. Es importante no perder de vista al analizar un genotipo y su posible fenotipo, que éstos pueden ser el resultado de un conjunto de eventos de mutación que requieren un fondo genético determinado para desarrollarse por lo que no siempre la interpretación de un fenómeno es tan sencilla.
En este paper, se hace el análisis experimental de cómo fue que se adquirieron cepas de Escherichia coli capaces de utilizar citrato, para esto siguieron aproximadamente a 10000 generaciones y lograron mapear la historia evolutiva de la adquisición de esta mutación, este trabajo resulta novedoso y complejo, porque no solamente se quedaron con la historia en el punto final, que es cuando el operón ya tenía el contexto para ser expresado, sino que fueron analizando y probando cada paso para determinar la historia evolutiva de esta mutación, probando las diferentes combinatorias, las diferentes construcciones, con el propósito de demostrar los efectos de éstas en cada paso, para finalizar con la arquitectura resultante de los procesos de duplicación génica.
Las novedades evolutivas son características que abren posibilidades ecológicas, promueven la diversificación y generalmente estas surgen a partir de genes con otra función. Las bacterias son buenos modelos experimentales para probar hipótesis relacionadas ya que se pueden congelar y revivir con el paso del tiempo. Por lo que en un experimento de doce poblaciones de Escherichia coli que han vivido en un medio limitado en glucosa durante 40 000 generaciones se encontró el surgimiento de una mutante capaz de utilizar el citrato presente en el medio (se sabe que Escherichia no utiliza esa fuente en condiciones aerobias). ¿Como surgió3 esta mutante?
Se secuenciaron 29 clonas muestreadas en varias generaciones. Se observo que muchos clados aparecieron después de las 2000 generaciones, uno de ellos dejo de aparecer a las 15 000 generaciones (extinción). Los clados C1, C2 y C3 coexistieron sin embargo el reloj molecular demostró que C1 divergió del ancestro de C2 y C3. El clado C3 contiene miembros Cit+/- pero las cit+ aparecieron hasta la generación 31 000. La evolución de Cit+ implica tres procesos: potenciación, actualización y refinamiento.
Durante el proceso de actualización el operon cit es amplificado y en los rearreglos se acomoda frente a un promotor que lo transcribe. Sin embargo para que esta mutación tuviera un mayor efecto tuvo que pasar por un proceso de refinamiento que consistió en aumentar el numero de copias de la construcción rnk-citT. Finalmente el proceso de potenciación nos dice que es necesario un contexto genético donde la nueva mutación se pueda expresar de modo que en este experimento se encontraron relaciones epistaticas cuando se probo la construcción en diferentes contextos genéticos.
Entonces la aparición de esta novedad evolutiva y la genómica permitieron en este articulo rastrear las mutaciones que dieron origen a la novedad y nos deja ver un poco el efecto del azar y a la vez la importancia del contexto genético.
Como parte de los resultados del experimento de evolución de E. coli, la aparición de mutantes con la capacidad para utilizar citrato en condiciones aerobias resulta muy interesante. En generaciones tempranas estas mutantes son raras pero en generaciones más tardías se vuelven dominantes aunque aún se distingue la presencia de Cit -. Entender el mecanismo mediante el cual las mutantes Cit+ ocurren y desplazan a las Cit – hace palpable el valor de comprender la historia evolutiva de la población. Del estudio de su filogenia a partir de la comparación de secuencias, se observó que las mutantes Cit+ poseen una modificación en el gen mutS que surge después de la aparición del origen de estas mutantes.
Como parte de la evolución de las mutantes Cit+, ésta comprende la potencialización (de acuerdo al contexto genético la función es accesible por medio de mutación), actualización (aparición de una Cit+ débil) y el refinamiento (de la nueva función para que sea más eficiente). Parece ser que este grupo surge de la amplificación mediada por la captura de promotor (por el módulo rnk-citT) y la adición de otras mutaciones refina la función para que sea más eficiente en las siguientes generaciones, p. ej., la duplicacipon de versiones alternativas de rnk-citT. Con estas clase de mutaciones, al alterarse la regulación de genes se puede modificar la función de forma benéfica con lo que surge una innovación evolutiva que puede representar una ventaja funcional.
El objetivo de este artículo es reconstruir la historia de las mutaciones Cit+ sobre la población de Escherichia coli sujeta a evolución experimental y dar pistas sobre la evolución de nuevos fenotipos. Esta mutación permite la utilización de citrato en crecimiento aeróbico. Secuenciaron los genomas de 29 clonas (9 de Cit+ y 3 Cit-) y reconstruyeron la historia filogenética de las poblaciones, identificando polimorfismos, indels y rearreglos. En las clonas Cit+ apareció una mutación sobre mutS que afecta la reparación del DNA y causó una mayor acumulación de mutaciones. La evolución de Cit+ implicó tres procesos de potenciación, actualización y refinamiento. Es interesante que se observa la amplificación modular de conjuntos de genes funcionalmente relacionados como operones y que dirige la evolución del fenotipo Cit+. Igualmente se identifican 3 clados que surgen a lo largo de las 40,000 generaciones y en donde se aprecia el surgimiento de ciertos linajes altamente mutantes. Se hacen las construcciones para poner a prueba las hipótesis con los genes y módulos observados y se aprecia cómo los cambios en el número de copias va refinando la adaptación, y esto se da naturalmente por recombinación. En sus experimentos clonando las copias de los módulos de rnk-citT demuestran cómo se mejora el fenotipo Cit+ y permite la expansión de la población. La potenciación es asociada con clonas que incrementaron sus tasas de mutación para Cit+ pero también con mutaciones que surgen en generaciones previas. En este punto hay las hipótesis de la epistasis y de la promoción física que a través, por ejemplo de rearreglos y elementos móviles, expliquen la potenciación. El estudio con Cit+ arroja evidencias hacia la epistasis aunque queda aún abierta la importancia de ambas hipótesis en los procesos adaptativos y de innovación a nivel del genoma.
Las adaptaciones o caracteres evolutivos otorgan nuevas oportunidades ecológicas para que los organismos se sitúen mejor en su ecosistema y también promuevan la formación de nuevas especies. Estos caracteres son el resultado de cambios en genes que tenían una función previa, la cual es cambiada por efecto de mutaciones que propician el desarrollo de una nueva función. Para comprender la relevancia que tienen estas nuevas funciones es importante analizar su efecto funcional y ecológico. Una alternativa para poder ver ese tipo de efectos en los organismos es la evolución experimental aplicada en microorganismos, ya que tienen tiempos generacionales cortos y un tamaño poblacional grande. Es este estudio analizaron genómicamente 12 poblaciones de E. coli que alcanzaron 40,000 generaciones y que fueron cultivadas en un medio limitado de glucosa, pero que contenía citrato en cantidades considerables. Esta especie bacteriana se caracteriza por no poder metabolizar dicho compuesto. Sin embargo, a lo largo de 31,000 generaciones bajo estas condiciones de cultivo, aparecieron mutantes con la capacidad de metabolizar dicho compuesto (Cit+) y que alcanzando las 31,000 generaciones se vuelven el genotipo dominante sin desplazar a las bacterias que no tienen dicha capacidad (Cit-). Todo parecía indicar que los clones que se obtenían en las últimas generaciones eran los que había obtenido dicha capacidad metabólica, lo cual fue explicado como el resultado de un incremento en la tasa de mutación con efectos en las últimas generaciones, o por el desarrollo de interacciones epistásticas para que la capacidad de metabolizar el citrato pueda ser expresada por efecto de otras mutaciones. Veintinueve clones analizados que incluían Cit+ y Cit- mostraron la presencia de polimorfismos únicos (ya sea por deleciones, inserciones o re-arreglos), las cuales al determinar su historia filogenética se observó que antes de las 20,000 generaciones se habían desarrollado nuevos clados. La coexistencia con los genotipos Cit- fue explicada como el resultado de la adquisición de mutaciones benéficas que no otorgaban una ventaja considerable y por ello no eran fijadas, o porque dicho genotipo logró ocupar otros nichos en los que pudo metabolizar otro tipo de metabolitos. El genotipo Cit+ de las últimas generaciones mostró una gran acumulación de mutaciones en comparación al Cit- o con el Cit+ que fueron aislados en las primeras generaciones del análisis. Por lo que, al analizar la dinámica del efecto de estas nuevas mutaciones se determinaron 3 etapas: la potenciación, la actualización y su refinación. Esto fue observado por la formación del transportador que es específico para citrato, el cual tuvo que ser duplicado y en un determinado momento podría llegar a alterar la estructura genética y a los elementos regulatorios; en este caso, el genotipo Cit+ se obtuvo de su amplificación por ser capturado por un promotor. Inicialmente, el genotipo Cit+ era débiles para explotar el citrato del medio, pero su incremento de abundancia asociados al surgimiento de nuevas mutaciones, permitió que refinaran dicha función. Sin embargo, su composición genética no lograba justificar su expansión poblacional; sin embargo, todo parece indicar que los que presentan varios de estos cambios tienen una ventaja adaptativa sobre los que no los tienen junto con la duplicación del grupo de genes asociados al metabolismo de citrato. Esta parte del proceso fue considerada como el resultado de la recombinación genética y la refinación de otras mutaciones débiles. Así también, se consideró que para desarrollar esta capacidad metabólica era necesario tener un “background” genético que permitiera que las nuevas funciones fueran más accesibles a las mutaciones. La potenciación de este genotipo requirió de al menos 2 mutaciones, que fueron desarrolladas durante su proceso de divergencia; ocurriendo por efecto de la epistásis o por dicho “background” promovido por las mutaciones desarrolladas en la etapa final del experimento. Sin embargo, los resultados observados no logran justificar que un solo proceso haya ocurrido, por lo que es muy probable que haya sido el resultado de la acción balanceada de ambos. A pesar de lo anterior, las mutaciones cit+ fueron las responsables de la evolución de esta capacidad metabólica; sin embargo, no se puede descartar la promoción por contacto físico o por efecto de la epistásis. Por lo que el “background” genético también es de relevancia para actualizar y hacer efectivos dichos cambios genéticos.
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