The molecular diversity of Adaptive Convergence
Olivier Tenaillon, et al. Science 335, 457 (2012); DOI: 10.1126/science.1212986
To estimate the number and diversity of beneficial mutations, we experimentally evolved 115 populations of Escherichia coli to 42.2°C for 2000 generations and sequenced one genome from each population. We identified 1331 total mutations, affecting more than 600 different sites. Few mutations were shared among replicates, but a strong pattern of convergence emerged at the level of genes, operons, and functional complexes. Our experiment uncovered a set of primary functional targets of high temperature, but we estimate that many other beneficial mutations could contribute to similar adaptive outcomes. We inferred the pervasive presence of epistasis among beneficial mutations, which shaped adaptive trajectories into at least two distinct pathways involving mutations either in the RNA polymerase complex or the termination factor rho.
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The Molecular Diversity of Adaptive Convergence
Tanto la tasa y el efecto de mutaciones benéficas, varían durante el curso de adaptación debido a la presencia de interacciones epistaticas que modifican y amplían el fitness. En este trabajo trataron de estimar el número de diversidad y mutaciones beneficiosas que se producen en E. coli a temperaturas elevadas, 42.2°C, durante su adaptación. Secuenciaron 115 clones que crecieron a 2000 generaciones. Para medir el fitness de las clonas se midió la competencia con la cepa ancestral y para todas aumento marcadamente en un 1.42.
En la secuenciación hallaron 1258 cambios moleculares con un promedio de 11 eventos por clon siendo mayormente las mutaciones de inserciones y deleciones y mutaciones puntuales, siendo estas últimas probables para adaptación evolutiva.
La convergencia que se mostraba en las mutaciones era mayor a nivel de genes y complejos multifuncionales, que en otros sitios.
Los complejos funcionales probablemente eran blancos de la selección. Ubicando que los mayores sitios de mutaciones benéficas eran agrupados dentro de pocas unidades operacionales como la RNApolimerasa y los operones rpoS. Sin embargo, el potencial de que una mutación puede ser benéfica o deletérea depende del esqueleto génico, dentro de los genes, epistasis.
La mayoría de los promotores como ICLR, CLS, KPS, YBAL, GLP, rho y rpoD no acumulaban más de una mutación debido a que podía haber epítasis negativa, y podría ocasionar la inactivación de un gen. Con excepción de la RNApol que acumulaba más de una mutación y rpoB a diferencia de los demás genes tiene dos o más mutaciones en un solo genoma, debido a que su operon, rpoBC, es pleiotrófico y el suceso de múltiples mutaciones es compatible con selección para mutaciones compensatorias o múltiples fenotipos.
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¿Las mutaciones “benéficas” realmente “avivan” la adaptación biológica? Los estudios que abordan la tasa y efecto de las mutaciones benéficas, hasta ahora han sido solamente estadísticos. Este artículo plantea que el número de mutaciones benéficas y su diversidad, podrían ser evaluadas experimentalmente, para lo cual se requiere un gran número de replicas, secuenciar el genoma completo para que las mutaciones sean detectadas sin ambigüedad y un sistema biológico complejo que asegure las potenciales soluciones no son triviales.
Entonces, el modelo empleado en el estudio consiste en caracterizar la respuesta genética de E. coli a las altas temperaturas (42.2°C) y secuenciar el genoma completo de 115 replicas!!
Se desarrollo un nueva “pipeline” computacional para detectar todas las mutaciones de novo en las 115 clones secuenciados. Se detectaron un total de 1258 cambios moleculares de diverso tipo (mutaciones puntuales, inserciones, deleciones cortas y largas, inserciones , duplicaciones) con un promedio de 11 eventos por clon. Me llama la atención que no existió correlación entre el “fitness” de los clones y el número de mutaciones, pero el punto donde ocurre la mutación sí tuvo una fuerte señal adaptativa.
Los elementos de inserción podrían estar representando la base de los eventos de mutación adaptativa. Al mismo tiempo se cree que aún se está lejos de detectar todas las mutaciones benéficas posibles.
¿Cómo se sabe que la mutación detectada es benéfica o que el sitio en el que ocurre contribuye a una respuesta adaptativa? Se desarrollo un modelo de muestreo de mutaciones que involucra la mutación en sí o el sitio de la mutación (L), la tasa de mutación (m) y el coeficiente de selectividad (s). Este modelo estima el número de sitios mínimos que se requieren para producir las mutaciones observadas. Así, por ejemplo, para generar las 400 mutaciones detectadas en un sitio determinado se requieren L=850, sin considerar la varianza de m y s.
Por otra parte, también se analizó si la interacción entre las mutaciones benéficas, da forma a la trayectoria adaptativa. Se infiere que existe una epistasis entre las mutaciones benéficas que dirige la trayectoria adaptativa de al menos dos distintas vías que involucran mutaciones tanto en el complejo RNA polimerasa como en el factor de terminación rho.
La naturaleza adaptativa de los cambios que se dan al interior de los genomas puede variar pero conferir ventajas similares a distintas poblaciones. En este estudio de hizo un análisis a profundidad de los cambios experimentados por 115 clonas de E. coli a las cuales se les puso a evolucionar bajo condiciones experimentales de mayor temperatura (42.2 grados) por 2000 generaciones, para encontrar su efecto sobre la tasa de sobrevivencia y la habilidad competitiva de las diferentes cepas que surgían conforme el tiempo. En este tiempo, en la cepas se acumularon en promedio 11 cambios en cada una, de los cuales, alrededor de 7 eran mutaciones puntuales y 2 inserciones cortas, además de 1 inserción larga y menos de una inserción larga (lo que quiere decir que no ocurría en todas). La tasa de cambios no sinónimos fue bastante alta, lo que nos dice que la mayoría de estos fueron adaptativos. Las mutaciones puntuales fueron variables entre las poblaciones, pero aquellas que involucraban elementos de inserción eran muy parecidas entre diferentes réplicas. Agrupando las mutaciones atendiendo a su significancia funcional, un cambio compartido se daba con una frecuencia relativamente grande en genes asociados al complejo de la RNA polimerasa. En la figura 1 se resumen los tipos de mutación y su frecuencia con detalle. La figura 2 me parece la más interesante del artículo pues resume las pruebas que revelan el número potencial de mutaciones beneficiosas que ocurren dependiendo de el largo de las secuencias analizadas y del tipo funcional de secuencia: En el panel A se observa que en las unidades funcionales, es mucho más probable encontrarse dos mutaciones beneficiosas de lo que esperaríamos por azar en una unidad funcional. En el panel B se ve que el número de mutaciones puntuales seguiría aumentando conforme se examinaran más secuencias. En el panel C está el resultado de aplicar un modelo para inferir el número posible de mutaciones puntuales que confieren un beneficio en término del número de mutantes que se tienen que contar. El resultado apoya el panel A en el hecho de que las mutaciones beneficiosas parecen agruparse en los clusters funcionales. El análisis de las interacciones epistáticas se hizo utilizando índices para detectar asociaciones que diferían del azar, es decir, pares o grupos de mutaciones que tendían a aparecer juntas o no. Ejemplos específicos incluyen la asociación negativa de la mutación ybaL con otras, y ejemplos positivos las mutaciones asociadas a la mutación rpoBC. Este tipo de análisis es el más interesante pues nos dice que secuencias de mutaciones están asociadas a cambios adaptativos; en este caso se detectaron dos líneas paralelas de cambios que tienen un resultado más o menos similar en el cambio de adecuación que le dan a la población.
La evolución es determinista o estocástica? Si la evolución es determinista, por lo tanto es predecible. Si es estocástica, es impredecible. ¿Que pasaría si uno reproduce la cinta de la evolución? ¿Los resultados de la evolución serían totalmente diferentes o se repetirían?. Bajo este mismo esquema, al tener poblaciones iguales, en un ambiente controlado, se puede llegar al mismo destino por diferentes caminos, o las poblaciones seguiran la misma ruta evolutiva. Esta última cuestión, fue la base para llevar a cabo el trabajo que publicaron en Science en el 2012, Tenaillon y colaboradores. En este trabajo, retoman el experimento de largo plazo de Lenski pero con un mayor poder estadístico y un mayor número de replicas. En este arduo trabajo secuenciaron 115 clonas de E.coli adaptadas independientemente a “altas” temperaturas ( 42..2°) lo anterior lo realizaron con el fin de estimar el número y diversidad de mutaciones benéficas que las 115 poblaciones pudieron haber generado a lo largo de 2000 generaciones. Al analizar los genomas completos , y hacer bastantes pruebas estadísticas robustas, los autores se dieron cuenta que las secuencias genomicas cubrían un increible patrón de vías adaptativas individuales, además de que se compartían pocas mutaciones entre los genomas, sin embargo a pesar de compartir pocas mutaciones, observaron de la existencia de un patron de convergencia en dos trajectorias evolutivas competitiva para la adaptación a altas temperaturas. Los autores definieron a las vías en dos “bloques evolutivos”. En la primera vía se encuentran los genes que codifican subunidades de la RNA polimerasa, principalmente el gen que codifica la subunidad beta (rpoB) en el cual observaron que se encuentra en epistasis positiva con rpoD y con operones de la biosintesis de valina, e isoleucina), genes del complejo de secrecion (KPS), genes de respuesta general a estres (RSS) y genes ROD. La segunda vía esta involucrada en la mutacion del factor de terminación rho, la cual previene la adquisiscion de mutaciones en rpoBC. En estas dos vía independientes se esperaría que la adecuacion en las clonas fuera diferente, sin embargo, no encontraron diferncia en el promedio de la adecuación entre clonas que atravesaron ambas vías. Los autores concluyen que estas vías sugieren interacciones entre una mutacion benefica, y bloques enteros de mutaciones beneficas potenciales. Con este trabajo se podría pensar que las mutaciones individuales (limitadas a nivel de unidades funcionales) y unas cuantas vías evolutivas, pueden definir la evolucion de poblaciones a nivel genómico. Sin embargo, una aclaración que me hubiera gustado que se puntualizara más en el articulo, es demostrar si estas cepas eran “mejores” con respecto al ancestro, y de esta forma definir no solo estadisticamente, si no fisiologícamente si las clonas de las poblaciones llevan caminos aleatorios para un mismo fin, reflejado en la función.
El efecto que pueden tener las mutaciones en un organismo está influenciado en cierta medida por la tasa en que éstas se presentan así como a interacciones epistáticas que pueden modificar el efecto en su adecuación. Muchas veces el conocer el fondo genético sobre el cual se están dando las mutaciones no es del todo trivial pues se debe poder diferenciar entre aquellas mutaciones neutras y aquellas que presentan un efecto real. Para intentar contestar esto, en este trabajo se analizaron 115 poblaciones de E. coli por 2,000 generaciones a una temperatura de 42.2 ºC para finalmente secuenciar una clona de cada población y analizar su adecuación respecto al ancestro.
La primer parte que se hizo fue el identificar todas las mutaciones de novo respecto al genoma referencia, encontrándose un total de 1258 cambios en las 114 líneas que se estudiaron al final. De estos cambios la gran mayoría estuvo dada por mutaciones puntuales seguida por indeles, mientras que los eventos más raros fueron eventos grandes de duplicación. Si bien el número de mutaciones en cada línea fue distinto, no se encontró alguna correlación entre la adecuación y el número de mutaciones.
Al hacer un agrupamiento de aquellos genes que presentaron más de cinco mutaciones, se observó que el complejo RNApol era un blanco pues acumuló un total de 205 mutaciones, siendo de entre estos rpoB el más mutado con un total de 87 cambios. Otro de los blancos fueron las proteínas responsables de la respuesta a estrés (RSS), las cuales por trabajos previos se sabe que son un blanco de selección bajo altas temperaturas. Al estimar el número de sitios que están contribuyendo a la respuesta adaptativa, se encontró que la gran mayoría de los potenciales sitios benéficos estaban localizados en pocas unidades operacionales.
Posteriormente se analizó el efecto epistático de las mutaciones encontradas en las líneas estudiadas mediante un análisis de re-muestreo, encontrándose un patrón de epistasis negativa en el cual la fijación de una mutación benéfica convierte cientos de mutaciones potencialmente adaptativas en neutras o deletéreas, a excepción de RNApol en donde se encontraron más de una mutación por línea.
Finalmente podemos decir que la diversidad de fenotipos que podemos observar en una población particular va a estar dada por una interacción dinámica de las diferentes mutaciones benéficas o potencialmente benéficas, las cuales si bien pueden tener una distinta base genética entre ellas, en conjunto nos pueden proporcionar un fenotipo, en este caso una adaptación a altas temperaturas, común.
En este artículo quieren evaluar cuáles son las mutaciones que sufren poblaciones de Escherichia coli cuando son sometidas a más de 41.5° de temperatura, para esto utilizaron 115 poblaciones y las pusieron a crecer por un periodo de 2000 generaciones, ya que es el tiempo en donde se han visto mayores cambios en las mutaciones.
El resultado fue que encontraron 1331 mutaciones las cuales se localizaron en aproximadamente 600 lugares diferentes del genoma, una ves teniendo este dado, analizaron en donde se encontraban, si eran mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, duplicaciones, etc.
Sin embargo, pese a haber mapeado en muchos lugares diferentes, el efecto de muchas mutaciones benéficas no es del todo visible, no obstante, se demostró que hay una co-ocurrencia de las mutaciones, las cuales llegaron a ser las más importantes para soportar los cambios de temperatura, estas mutaciones, terminaron siendo parte de las vías involucradas con la RNA polimerasa y el factor Rho.
El comentario correspondiente a este artículo es el siguiente:
Para este artículo, se analizó la tasa de mutación a lo largo de 40000 generaciones en una cepa hipermutante, a partir de análisis estadísticos, que tenía una mutación en los genes mutT, posteriormente se evaluó la historia evolutiva de estas mutaciones, así como la frecuencia en la que éstas se fijaban, para completar el análisis, se analizaron los tipos de susticiones en los nucleótidos de acuerdo al fondo genético de cada cepa, ya que al estar afectados los genes mut, las cepas la tasa de mutación se incrementaba considerablemente con respecto a la WT.
Estos análisis llevaron a los autores a concluir que la tensión que hay entre la evolución adaptativa y la reducción de la carga genética depende del ajuste entre la población y su entorno, teniendo en cuenta que la reducción de la carga genética provoca que la población se adapte a las circunstancias.
La mutación es el combustible para la adaptación, sin embargo aun no se sabe cual es su diversidad potencial. ¿Podrá la adaptación ocurrir vía mutaciones convergentes idénticas o a través de diferentes rutas?. Con el animo de probar esta hipótesis se construyo un experimento con 115 replicas donde todas las clonas provenían de la misma clona y fueron expuestas a una presión ambiental que fue temperatura 42º centígrados por 2000 generaciones, al termino del experimento se secuencio el genoma de una clona de cada replica y se comparo con el ancestro.
Se observo que la mayor parte de las mutaciones no sinónimas e intergenicas fueron benéficas. A demás el experimento sugiere que hay muchísima más diversidad de posibles mutaciones adaptativas de las que se pudieron observar en el experimento (a pesar de ser 115 replicas).
Se encontraron dos líneas evolutivas. En la primera, una mutación en rpoBC esta bajo epistasis positiva con KPS, RSS y ROD, en la segunda rho determina la aparición de otra mutacion en rpoBC que a su vez favorece la selección de otras mutaciones. Estas dos líneas al ponerse a competir no revelaron ninguna diferencia en la adecuación.
Finalmente, con 115 replicas no se observo una misma ruta evolutiva convergente entre los linajes sino dos rutas distintas que convergen. Se demuestra también la importancia de las interacciones entre las mutaciones benéficas que van surgiendo, ya que a su vez van abriendo paso a nuevas posibles mutaciones.
Para poder entender si la adaptación se da por mutaciones convergentes o si ocurre por diferentes vías alternas, se observó la respuesta de varias líneas de E. coli ante altas temperaturas para caracterizar su respuesta genética. Considerando también que la diversidad y el número potencial de mutaciones benéficas puede ser estimado a partir de experimentos cuidadosamente controlados y con un número adecuado de réplicas. De esta manera, se realizó la propagación seriada de varias clonas, de forma independiente, extendiéndose a 2 000 generaciones, cuando se secuenció el genoma de una clona de cada línea para identificar las mutaciones de novo. De este estudio se aprecian dos trayectorias evolutivas.
De esto se observó que algunas mutaciones son compartidas entre estas líneas. Mutaciones puntuales no sinónimas, deleciones (algunas de las cuales se traslapan con elementos IS, relacionados con la deleción mediada por recombinación homóloga), duplicaciones, inserciones, etc. Sin embargo, parece que las mutaciones a nivel de genes tienen un papel más importante para evaluar la convergencia. Que un gen sea blanco de varias mutaciones y no se dé por azar podría indicar la importancia de éste en la adaptación a las condiciones ambientales.
A nivel funcional, la convergencia también se observa. El complejo RNApol es un blanco (que parece ser específico para las temperaturas elevadas) y contiene al gen con más mutaciones (rpoB). Al parecer, un número considerable de sitios potencialmente benéficos se agrupan en algunas pocas unidades funcionales. Además, se aprecian tanto interacciones de epistasis negativa (cuando se fija una adaptación benéfica y transforma otras en neutrales o en deleciones) entre mutaciones benéficas y también epistasis positiva, de acuerdo al contexto genético.
De las dos trayectorias evolutivas observadas, una corresponde a las mutaciones en rpoBC con epistasis positiva con cambios en rpoD, ILV, KPS, RSS y ROD. La segunda corresponde a la mutación en rho que desalienta las mutaciones en rpoBC y favorece mutaciones en cls e iclR. Ambas no difieren en la aptitud de las clonas que atraviesan por una u otra vía. Igualmente, se aprecia una interacción dinámica entre mutaciones benéficas solas o en bloques, donde mutaciones potencialmente benéficas que afecta a un bloque suelen convertirse en neutras o en deleciones que permiten abrir la posibilidad de nuevos bloques de selección.
El objetivo de este artículo fue realizar un análisis sobre las mutaciones benéficas que ayudan a la adaptación, una de las preguntas que los autores plantearon fue si esta mutaciones provienen a través de una mutación convergente o de diferentes rutas alternativas. Diversas investigaciones sobre las mutaciones benéficas se han realizado, sin embargo están limitadas por el número de replicas que realizan, en este trabajo se propone caracterizar la respuesta genética de E. Coli a altas temperaturas (42.2 C) con 115 replicas de población secuenciando un genoma por cada población. Este análisis mostró 1258 cambios moleculares, estimaron que aproximadamente el 80% de las mutaciones no sinónimas e intergénicas fueron benéficas. Además los autores observaron que hay mutaciones que convergen a nivel de genes, operones y unidades funcionales. El mayor número de mutaciones afecta al
complejo de la RNA polimerasa con 205 mutaciones y el menor número actúa sobre genes que regulan la respuesta general al estrés. Por otro lado, también encuentran mutaciones basados en patrones epistáticos. Lo que los autores proponen a partir de su estudio es que las mutaciones convergen y son distintas unidades sobre las que opera esta convergencia adapatativa, y explican en qué consiste esa diversidad molecular que se genera con los experimentos evolutivos en bacterias. Esto es a nivel de mutaciones puntuales, sobre los genes, los operones y unidades funcionales, lo que además concluyen se da mediante bloques sujetos a selección, y que tienen efectos diversos debido a la asociación entre estos varios niveles de organización estructural y funcional del genoma.
A lo largo de los procesos evolutivos es común que los organismos que han adquirido alguna ventaja adaptativa se sitúen mejor en el ambiente y que aquellos que presentan dicha variación empiecen a ser los organismos dominantes. Asociado a este proceso han surgido interrogantes para tratar de entender como ocurre dicho proceso. Principalmente se ha pretendido entender si estas adaptaciones se dispersan como un evento convergente o por algún otro mecanismo, y/o si estos mecanismos están regidos por la interacción de diferentes mutaciones benéficas. La tasa de mutación y el efecto que generan en los organismos varía a lo largo del proceso adaptativo por acción de la epistásis, modificando la adecuación de los organismos. Experimentalmente, bajo condiciones de estricto control y con varias réplicas, se ha observado el surgimiento mutaciones benéficas. Actualmente, con los avances en el área de la genómica es posible identificarlas y observar su efecto en la funcionalidad de los organismos. En este experimento, analizaron 115 genomas de E. coli para observar su respuesta al estrés generado por el incremento de la temperatura (42.2ºC). Al mismo tiempo, se analizaron otros 100 genomas de esta bacteria provenientes de una cepa adaptada a crecer a 37ºC, la cual fue mantenida en crecimiento a lo largo de 2,000 generaciones en un medio mínimo a la misma temperatura experimental. De manera general, se observó que este incremento de temperatura genera una selección fuerte; sin embargo, el proceso adaptativo no se lleva a cabo completamente a pesar de observarse un incremento en su adecuación en comparación con la cepa ancestral. De los 115 aislados seleccionados, uno de ellos mostró una elevada tasa de mutación viéndose reflejado en su adecuación con un gran número de mutaciones desarrolladas; por lo que no fue considerado para los siguientes análisis. Con el resto de los genomas analizados se identificaron 1258 polimorfismos que no mostraban una relación entre la adecuación y el número de mutaciones desarrolladas; sin embargo, algunas mutaciones puntuales mostraron una fuerte señal de selección positiva. Así también, se observó que el 80% de las mutaciones intergénicas y sinónimas eran benéficas. Esto fue considerado como el resultado de un proceso de evolución convergente, reflejando variaciones en el tipo de mutación. El proceso que fue considerado como de mayor importancia en la generación de esta variación genética fue el efecto generado por las secuencias de inserción. Por lo que, en este experimento la dispersión de las mutaciones ocurrió por convergencia entre genes los genes que en sitios puntuales. Este patrón fue identificado en el complejo proteico que conforma a la RNApol en la que se observaron 205 mutaciones, siendo el gen rpoB el que presentaba un mayor número de mutaciones. Así también, varias de los sitios con cambios potencialmente benéficos se encontraron en algunas unidades operacionales. Al analizar el efecto que podría generar la interacción entre mutaciones, se observó un efecto epistático negativo, ya que la fijación de una sola mutación afecta una gran cantidad de mutaciones. La única excepción fue lo observado en RNApol que acumula una mutación dentro de una sola línea, con mutaciones asociadas a la tolerancia al incremento de temperatura. Sin embargo, no existió un patrón general en la interacción entre mutaciones, ya que en algunos casos se observó una interacción positiva y en otros una interacción positiva.
Por lo que, en este experimento se observó que una sola mutación benéfica afecta a su propio bloque de mutaciones potencialmente positivas, y pueden abrir a otros bloques afectando la amplitud y la señal del efecto mutacional dentro de este nuevo bloque
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