Aplicación de métodos de etiquetado estocástico con códigos de barra de secuencia aleatoria para la cuantificación y secuenciación simultánea de genes 16S rRNA ambientales
Los métodos de secuenciación de nueva generación (NGS) han permitido el estudio de las comunidades microbianas a nivel molecular. En ocasiones los investigadores requieren saber el número de copias de cierta secuencia en la muestra. Para ello se han empleado métodos cuantitativos basados en PCR (qPCR y dPCR). Sin embargo el número de secuencias obtenidas después de PCR no siempre refleja el número de copias originales en la muestra debido a sesgos de la reacción.
En este artículo se propone un método para saber el número de copias de una secuencia en particular en una biblioteca de NGS. Los autores aplican un etiquetado estocástico que permite la secuenciación y la cuantificación simultánea del ADN blanco. Este método consiste una secuenciación quantitativa inicial (qSeq) a partir de un extensión con un primer (SPE) el cual tiene una etiqueta aleatoria adyacente al extremo 5′ de la secuencia específica. Durante SPE cada molécula de ADN es etiquetada, y se lleva a cabo una primera ronda de PCR dirigida al producto SPE. Una segunda ronda de PCR produce el índice para NGS. El número de etiquetas aleatorias se determina solamente durante el paso de SPE y por ello no es afectada por las rondas de PCR las cuales pueden causar sesgos en la amplificación. En el caso de los genes 16S rRNA, se puede saber el número absoluto de filotipos contando el número de etiquetas aleatorias que se incorporaron al final de la secuencia basándose en una distribución de Poisson. Los autores probaron su método en Sulfolobus tokodaii, en una imitación de comunidad microbiana. Para ello usaron 65,536 códigos de barra con secuencia aleatoria. Cuantificaron exitosamente copias en S. tokodaii en concentraciones de 5.0 x 103 – 5.0 x 105, pero la precisión disminuía con un número de copias mayor a 1.0 x 105. En el análisis de la comunidad microbiana, cuantificaron un total de 2.0 x 104 copias que contenían cantidades equivalentes de seis especies de bacterias. Los autores también probaron el método en muestras ambientales (arena de playa, suelo, biofilm y aguas termales). Sus resultados son consistentes con cuantificación por dPCR.
Tatsuhiko Hoshino, Fumio Inagaki. 2016. Application of the stochastic labeling methods with random-sequence barcodes for simultaneous quantification and sequencing of environmental 16S rRNA genes. ; doi: http://dx.doi.org/10.1101/072298
