Priming de la promoción del crecimiento vegetal por volátiles producidos por Microbacterium spp. asociadas a raíz
Las asociaciones ente bacterias y plantas producen un sinfín de metabolitos, incluyendo compuestos orgánicos volátiles (VOCs). Estos son moléculas de bajo peso molecular con una presión de vapor muy alta que pueden dispersarse a través de la matriz del suelo, facilitando las interacciones a larga distancia de las plantas con los microorganismos sin necesidad de contacto. A pesar de que se sabe que las bacterias pueden producir volátiles como 2,3-butanodiol y 3-hidroxi-2-butano, se ha encontrado que éstos pueden promover el crecimiento vegetal de plántulas in vitro. Sin embargo, su efecto sobre el crecimiento de las plantas in situ ha sido poco explorado.
El género Microbacterium del filo Actinobacteria, puede producir hormonas de crecimiento vegetal como el Ácido Indol Acético (AIA), además de algunas deaminasas. Géneros de Microbacterium que han sido aislados de rizósferas de trigo, mejoran el crecimiento de plántulas de trigo y reducen las infecciones causadas por patógenos, se ha propuesto que esto es el resultado de la acción de los volátiles que produce la bacteria. Sin embargo, los mecanismos por los cuales los volátiles inducen la promoción del crecimiento vegetal se desconocen. Po lo que, en este estudio, investigadores de Bélgica y de los Países Bajos, estudian el efecto de los volátiles producidos por ocho especies de Microbacterium en la promoción del crecimiento vegetal de Arabidopsis thaliana. Específicamente, estudian si los volátiles pueden inducir priming, que se define como un mecanismo o sustancia que prepara a la planta para una acción futura, por ejemplo; mejorar el crecimiento. Además, están interesados en determinar si esto ocurre a través de la raíz o los brotes.
Para llevar a cabo este experimento primero aíslan especies de Microbacterium de raíces de Beta vulgaris (betabel). Para determinar la clasificación taxonómica de estos asilados, amplificaron el gen de 16s rRNA completo. Los resultados de secuenciación fueron comparados con las cepas tipo de Microbacterium para hacer análisis filogenéticos. Para los ensayos in vitro usaron semillas de A. thaliana Col-0, Lactuca sativa, lechuga y Solanum lycopersicum tomate. Para determinar el efecto de los volátiles de Microbacterium spp., se utilizaron cajas petri con dos compartimentos, en un compartimento se crecieron las semillas de las plantas mencionadas y en el otro los compuestos volátiles que produce la bacteria. En otro experimento pusieron a las Microbacterium spp. e hicieron hoyos en las cajas para que los volátiles pudieran desplazarse a las raíces y a las plántulas. Todos los volátiles producidos por las 8 cepas de Microbacterium fueron analizados por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas y acoplado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo. Finalmente, hicieron transcriptoma de las plantas expuestas a los volátiles.
Reportan el aislamiento de 26 especies de Microbacterium, de las cuales seleccionan 8 basados en su distribución filogenética. Una vez que seleccionaron a las cepas, ponen a crecer a las plántulas de Arabidopsis en presencia de los volátiles producidos por las 8 cepas de Microbacterium. Su resultado muestra que todas las cepas seleccionadas de Microbacterium fueron capaces de inducir el crecimiento vegetal hasta en un 230% en comparación con su control. Microbacterium sp. cepa EC8 fue la que favoreció el mayor incremento en la biomasa de las raíces, por lo que fue seleccionada para tratar de determinar los mecanismos que promueven el crecimiento vegetal. También, prueban el efecto de esta cepa con semillas de lechuga y tomate y encuentran que tiene un efecto en la promoción del crecimiento (Figura 1).
Plant growth promotion by volatiles emitted by Microbacterium strains. (A) Phenotypic changes of Arabidopsis seedlings exposed to volatiles from eight Microbacterium strains spot-inoculated on agar medium (10 μl at 109 CFU · ml−1) or from the agar medium only (ctrl). Pictures were taken 14 days after exposure. (B and C) Biomass (mean ± standard error [SE], n = 4 to 5) of shoots (B) and roots (C) of volatile-exposed and control seedlings. Different letters show statistically significant differences (one-way ANOVA, Tukey’s HSD post hoc test, P < 0.05). (D) Phenotypic changes of Arabidopsis, lettuce, and tomato seedlings exposed to volatile compounds from Microbacterium strain EC8 or from the agar medium only (ctrl) for 12, 7, and 10 days, respectively. (E to G) Dry biomass (mean ± SE, n = 6 to 8) of shoots (E) and roots (F) and lateral root density (number of lateral roots/length [cm] of primary root) (G) of Arabidopsis, lettuce and tomato seedlings exposed to the volatiles from EC8. ctrl, control seedlings exposed to agar medium only; EC8, seedlings exposed to volatiles from EC8. Asterisks indicate statistically significant differences between volatile-exposed and control seedlings (independent samples t test, P < 0.05).
Después, determinan si la exposición de los volátiles producidos por Microbacterium EC8 puede inducir priming en las plantas, para ello, primero exponen a las semillas in vitro a los volátiles y posteriormente las trasplantan sin ninguna reexposición. Sus resultados muestran que en las semillas trasplantadas y bajo la primera exposición si hubo un incremento del 35% en la biomasa de los brotes, y la floración se ve favorecida en un 51% (Figura 2).
Priming effects by volatiles from Microbacterium strain EC8 on the growth of Arabidopsis and lettuce seedlings. (A) Shoot dry biomass, (B) flower stem length, and (C) number of flowers of Arabidopsis plants (mean ± SE, n = 9); (D) shoot dry biomass of lettuce plants (mean ± SE, n = 4 to 5). ctrl, control plants exposed to agar medium only; EC8, seedlings exposed to volatiles from EC8. Statistically significant differences between volatile-exposed and control seedlings were determined with an independent samples t test.
También determinan el efecto de Microbacterium EC8 en plantas que crecen en el suelo. Sin embargo, sólo observan un incremento en la biomasa de Arabidopsis, en la lechuga no se observó un incremento. Después, obtuvieron el perfil de los VOCs de cada una de las ocho cepas estudiadas de Microbacterium por medio del uso de Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas y encontraron que las cepas producen VOCs diferentes. Para adentrarse más en el estudio de los volátiles de la cepa EC8, analizan los perfiles de esta y encontraron que produce 18 VOCs diferentes y que los más abundantes contienen un grupo sulfuro en su estructura como el dimetil disulfuro y el dimetril trisulfuro. Para determinar si el sulfuro de los VOCs de esta cepa contribuye al crecimiento de las plantas, se usó el dimetil disulfuro y el dimetril trisulfuro para medir el efecto en las semillas de Arabidopsis. Solamente las plantas que fueron expuestas a bajas concentraciones de 1µM de dimetril trisulfuro mostraron un efecto positivo en su crecimiento (Figura 3).
Effects of synthetic sulfur volatile compounds on shoot and roots of Arabidopsis seedlings. (A) Experimental setup for exposing seedlings to volatile synthetic compounds in vitro. Shoot and dry weight (mean ± SE, n = 5) of Arabidopsis exposed to 20 μl of (B) dimethyl disulfide, (C) dimethyl trisulfide, and (D) mixture (1:1) of dimethyl disulfide and dimethyl trisulfide at different concentrations. Dichloromethane (DCM) was used as the solvent. Control plants were not exposed to volatile compounds. Different letters indicate statistically significant differences (one-way ANOVA, P < 0.05).
Para tratar de entender el mecanismo molecular asociado a la promoción del crecimiento de Arabidopsis por EC8 se llevó a cabo un análisis de RNA-seq. En donde se expuso a las plantas durante una semana a los compuestos volátiles de EC8. El enriquecimiento de genes se observó en aquellos relacionados con procesos de asimilación de nitrato. Dado que el nitrato ha sido reportado como un nutriente para las plantas y también actúa como señal en la regulación del carbono y el metabolismo del nitrógeno esto podría explicar el crecimiento favorecido observado. Además, también activa a un receptor de auxinas el TIR1, este receptor media la degradación del AIA.
Los VOCs producidos por Microbacterium representan un nuevo recurso de compuestos naturales para estimular el crecimiento de las plantas de forma natural. Además, el priming de las semillas se ve como una estrategia prometedora para la promoción del crecimiento vegetal en el que no se necesita de la exposición prolongada de la planta a los volátiles de EC8.
Referencia
Cordovez, V., Schop, S., Hordijk, K., Dupré de Boulois, H., Coppens, F., Hanssen, I., Raaijmakers, J. M., & Carrión, V. J. (2018). Priming of Plant Growth Promotion by Volatiles of Root-Associated Microbacterium spp. Applied and environmental microbiology, 84(22), e01865-18.F
