20 de marzo: A framework for human microbiome research.
Human, T., & Project, M. (2012). A framework for human microbiome research. Nature, 486(7402), 215–21. doi:10.1038/nature11209
A variety of microbial communities and their genes (the microbiome) exist throughout the human body, with fundamental roles in human health and disease. The National Institutes of Health (NIH)-funded Human Microbiome Project Consortium has established a population-scale framework to develop metagenomic protocols, resulting in a broad range of quality-controlled resources and data including standardized methods for creating, processing and interpreting distinct types of high-throughput metagenomic data available to the scientific community. Here we present resources from a population of 242 healthy adults sampled at 15 or 18 body sites up to three times, which have generated 5,177 microbial taxonomic profiles from 16S ribosomal RNA genes and over 3.5 terabases of metagenomic sequence so far. In parallel, approximately 800 reference strains isolated from the human body have been sequenced. Collectively, these data represent the largest resource describing the abundance and variety of the human microbiome, while providing a framework for current and future studies.
12 comentarios
Este artículo es reflejo de un proyecto bastante ambicioso pero muy bien estructurado. Empezando por la unión de esfuerzo a través del Consorcio para el Proyecto del Microbioma Humano (HMP) para proporcionar un marco de trabajo tanto para la anotación así como para el análisis de metagenomas obtenidos del cuerpo humano, llevando a cabo el procesamiento de muestras de 242 individuos sanos (18 partes del cuerpo) junto con el desarrollo y validación de protocolos y técnicas.
Este equipo desarrolló protocolos para la selección de los donadores así como para el muestreo, para generar, así como para interpretar la información. Incluso se creó el Centro de Análisis y Coordinación de Datos para servir de reservorio para toda la información creada y poder tener definidos los estándares para que otros investigadores contribuyan a enriquecer esta fuente de información. Así mismo, trabajaron diferentes aproximaciones para poder apreciar las variaciones en la información que pudiera desprenderse de los ensayos y el análisis para poder confrontar y elegir las técnicas más robustas y consistentes como estándares. Por ejemplo, se trabajó con secuencias del gen 16S rRNA, WGS para comparar con genomas de referencia, etc., incluso encargando a 4 diferentes Centros de Investigación la secuenciación (usando diferentes plataformas, mostrando consistencia en los resultados).
Para trabajar la estimación de la diversidad se optó por diseñar tres diferentes pipelines (el paquete mothur uno con parámetros muy astringentes y otro con parámetros laxos y usando el software QIIME). Así también, se procedió al análisis de la información por niveles, desde el ensamblaje (incluso, efectuando el reensamblaje de reads que no pudieron ensamblarse inicialmente, generando pool de éstos de acuerdo al sitio del cuerpo humano del que procedió la muestra); el alineamiento con genomas de referencia (tanto para bacterias, archeas, virus y microeucariotes) y la predicción de genes (mapeando los reads para caracterizar familias de proteínas y para la predicción de genes funcionales predichos a partir de los ensamblados.
Así mismo, no solamente pone a disposición de los usuarios el acceso a la información obtenida del análisis de las muestras evaluadas, los protocolos, herramientas, genomas de referencia, etc., sino que también se estimula la retroalimentación contribuyendo a enriquecer esta base de datos. De esta manera se contribuye a fortalecer la investigación sobre el microbioma del ser humano (tanto en estado óptimo de salud así como cuando se tiene algún padecimientos), poniendo este proyecto como ejemplo del diseño de proyectos similares y permitiendo el acceso de protocolos establecidos cuya calidad ya ha sido evaluada. Se presenta como un recurso valioso para esta clase de estudios.
La idea del proyecto del microbioma humano (HMP) es entender la variedad de comunidades bacterianas, sus genes así como los papales que juegan en las distintas fases de salud o enfermedad. Para esto se tomaron entre 15 o 18 muestras (dependiendo del sexo) de 242 individuos, a partir de las cuales se generaron perfiles para el 16S rRNA.
Este proyecto, al igual que como sucedió en su momento con el proyecto de secuenciación del genoma humano, cuenta con la participación de diversas universidades e institutos, la idea bajo esto es el contar con investigadores capacitados en las distintas ramas para conseguir una visión más integrativa, además de permitirles tener perspectiva distintas en cuanto al camino a seguir, un ejemplo de esto es la lista que mencionan de los “más buscados”, pues son taxas sobre los cuales se están enfocando tanto por aproximaciones basadas en cultivo como por single-cell,
El HMP se ha enfocado en generar genomas referencia de virus, bacteria y eucariontes, los cuales proporcionan una base para futuros trabajos de anotación metagenómica y análisis. Entre los análisis realizados se incluyen la secuenciación del gen 16S rRNA así como sus respectivos perfiles taxonómicos. Al igual que como observamos en el artículo de Gajer et al. 2012, se utilizaron las regiones variables del 16S. Uno de los retos a los que se enfrentaron fue a la presencia de secuencias humanas contaminantes, siendo éstas más abundantes en tejidos suaves como vagina y garganta. Para evitar estos artefactos se diseñaron protocolos para remover las secuencias contaminantes, resultando en la eliminación de aproximadamente el 49% de los reads. Del total de las secuencias de alta calidad remanantes, el 57.6% pudieron ser asociadas con genomas conocidos, siendo la mayoría de ellas (99.7%) asociadas a bacterias.
La realización de este tipo de proyectos hoy en día es de gran importancia pues como ellos mismos mencionan, se genera una gran cantidad de información, en este caso la meta de 3,000 genomas bacterianos con una calidad suficiente para ser referencias. La disminución en los costos de secuenciación y la mejora en los algoritmos de análisis de secuencias ha permitido en últimas fechas un incremento en este tipo de proyectos, por lo cual la cantidad de la información generada está dejando de ser una de las principales limitantes pasando a ser ahora su correcto análisis.
Control de Lectura.
Prácticamente podemos hablar de metagenómica aplicada a cualquier hábitat (suelos, océanos, plantas, etc.); en este caso se aborda el estudio del microbioma humano (definido como las comunidades y el contenido de sus genes, asociado al cuerpo humano).
La exploración de estas comunidades y de su relación con el hospedero humano la lleva a cabo un consorcio (HMP) fundado por el US-NIH, y básicamente esta enfocado en delinear protocolos de muestras en personas “sanas”.
La investigación incluye análisis de 16S rRNA, para un total de 242 donantes, que se muestrearon en 15 (hombres) o 18 (mujeres) sitios totales del cuerpo. Se colectaron un total de 5,298 muestras de las cuales se generaron un total de 5,177 comunidades taxonómicas basadas en 16S rRNA y WGS.
Las figuras 1 (a, b y c), muestran en general el comportamiento de los nuevos genes descubiertos en función de nuevos OTU´s encontrados. La tasa de nuevos genes es, en general más lenta que la de los nuevos OTU´s descritos.
No hay una descripción precisa de, por ejemplo, asignación taxonómica, familias de proteínas, etc. Únicamente se hace referencia a otras bases de datos (por ejemplo, 57.6% del total de “reads”, pertenecen a genomas conocidos).
Quizá el aspecto más relevante, o por lo menos así se presenta, es el hecho de que se desarrollaron nuevos protocolos (de muestreo, secuenciación, análisis) para posibilitar este proyecto y que los datos generados representan un gran recurso para describir la abundancia y variedad del microbioma humano, con una visión hacia futuros trabajos.
La generación de un proyecto metagenomico no es algo trivial; durante el desarrollo del proceso existen obstáculos que se complican aún mas cuando se intenta comparar metagenomas provenientes de diferentes sitios de muestreo, en donde varían: la sintaxis de los «metadatos», protocolos de extracción de DNA, la plataforma de secuenciación, sofwares, herramientas, y pipelines utilizadas. Siendo que al no existir una estandarización en la metodología y procesamiento de los dataset, se obstaculiza el análisis correcto de los datos. Lo anterior recalca la importancia del Consorcio de Projecto de Microbioma Humano el cual ha establecido el marco contextual para el desarrollo de protocolos y métodos estandarizados para crear, procesar e interpretar distintos tipos de datos metagenomicos provenientes de muestras de comunidades microbianas de una gran cantidad de individuos. El resultado es una colección de más de once mil especies biológicas que representan el microbioma humano, (ademas de muestras de sangre que se han reservado para investigaciones posteriores). Lo anterior, es un claro ejemplo de como diseñar y llevar a cabo un proyecto de esta magnitud, sabiendo sobrellevar cada obstáculo, y proponiendo estrategias para poder lograr un análisis comparativo entre una gran cantidad de datasets. Este trabajo sin duda alguna representa una referencia bastante sólida para projectos similares, y también para trabajos menos ambiciosos.
Existen en el cuerpo humano un gran número de comunidades microbianas, estas juegan un papel relevante en la salud y en la enfermedad. Los Institutos Nacionales de Salud (EUA) fundaron el Consorcio del proyecto del microbioma humano con el objetivo de realizar estudios de metagenómica de diferentes hábitats en el cuerpo humano.
Este artículo pertenece a una serie de artículos que muestran los resultados obtenidos hasta Junio del 2012 a partir de este proyecto. Este artículo en particular tiene el objetivo de establecer un marco teórico a partir del cual se puedan aprender mejoras en la obtención, secuenciación, ensamblaje e interpretación de los datos de metagenómica.
Dado que este trabajo fue llevado a cabo por un gran número de laboratorios de investigación uno de los pasos críticos en el desarrollo era establecer y estandarizar protocolos comunes que permitieran obtener información con la mayor calidad y también que fuera accesible e interpretable para todos.
Se muestrearon a un total de 242 individuos sanos en 15 a 18 lugares distintos, un total de hasta tres veces por región. Se obtuvieron 5,177 perfiles taxonómicos a partir de RNAr 16S, y secuenciación masiva. También se pudieron secuenciar, aproximadamente, 800 sepas de referencia aisladas a partir de este estudio.
Como resultado de los protocolos de estandarización, se desarrolló un algoritmo tipo “pipeline” que puede ser aplicado a estudios de metagenómica, no sólo de humanos sino en cualquier organismo y que favorecerá la toma de decisiones cuando no se tenga una base previa de la cual partir.
Control de lectura 23
A framework for human microbiome research Human, T., & Project, M. (2012). A framework for human microbiome research. Nature, 486(7402), 215–21. doi:10.1038/nature11209
Partiendo de la idea de que el cuerpo humano es una comunidad, podemos dividir nuestro cuerpo en diferentes comunidades, tal y como se puede observar en este artículo donde se caracteriza la composición microbiana de diferentes partes del cuerpo humano, incluyendo excremento, siendo allí donde hay mayor número de grupos taxonómicos. Vagina, faringe, estómago, excremento etc., son muy diferentes taxonómica y funcionalmente, pero en todas estas comunidades se descubre mayor número de genes nuevos que taxones. Una de las principales problemáticas metodológicas a las que se enfrentaron los investigadores es a que obtuvieron una gran cantidad de reads de DNA pero mas de la mitad fueron de humanos, entonces tuvieron que limpiar bien sus secuencias. Lo que yo pienso es que se deben mejorar las técnicas de toma de muestras con el propósito de evitar estas situaciones.
Era el control 24*
El instituto nacional de salud (NIH, por sus siglas en ingles), ha tenido como objetivo establecer protocolos estandars para el desarrollo de análisis metagenomicos, principalmente para proyectos del microbioma humano. A partir de una población de 242 adultos sanos, se obtuvieron miles de muestras de distintos sitios de su cuerpo, 15 sitios en hombres y 18 sitios en mujeres. Fueron colectadas 5,298 muestras, entre los datos del 16S y WGS se caracterizaron taxonómicamente 5,177 comunidades, a partir de hábitats como vías respiratorias, cavidad oral, intestino y vagina. El centro de coordinación y Análisis de los datos (DACC por sus siglas en ingles), genero un depósito para todas la WGS, y 16S del proyecto del microbioma humano. Con las secuencias de 16S generada por los cuatro centros de secuenciación que participaron, se estandarizo un protocolo para la clasificación de la estructura de la comunidad en base a OTU. Para poder evaluar la consistencia de los protocolos, se realizaron las pruebas en una comunidad prueba de 21 organismos conocidos. Los resultados de estos análisis llevo a adoptar para la amplificación y secuenciación de las muestras, la plataforma Roche-454 FLX titanium. Las secuencias resultantes del 16S consiste en regiones altamente conservadas que se alternan con 9 regiones variables con son usadas para la clasificación taxonómica. La cobertura de regiones variables de tres sitios V3, V5, y V35. Y otras dos dentro de otra cantidad de muestras para hacer perfil taxonómico complementario. Las pipelines utilizadas para procesar los datos, fue el paquete de “mothur”, que da herramientas de rigurosidad baja y alta. También la utilización de QIIME, que utiliza los datos como una estrategia de unión de OTUS. Las muestras sobrantes (749), fueron utilizadas para secuenciar WGS usando la plataforma Illumina GAIIx. A partir de un grupo de 681 muestras se tuvo una profundidad de 13 Gb. Y aparte 12 muestras de heces fueron secuenciadas por 454 FLX titanium. Ambas secuencias se eliminó el DNA humano, para limpiar las muestras. Los resultados para el ensamblaje metagenomico, fue a través del protocolo SOAPdenovo. Los reads que permanecieron sin ensamblar fueron mezclados sin importar el sitio de la toma de muestra, y fueron ensamblados. Las 12 muestras de heces, fueron generadas por ensamblajes híbridos usando Newbler. La comunidad microbiana fue la más abundante con un grupo de reads alineadas de 1,742, arqueas 131, virales 3,683, 326 de microeucariontes. Dos herramientas fueron utilizadas para resumir la función y metabolismo del microbioma humano, produciendo dos datos de grupos primarios. El primer grupo anotación fue producido por mapeo de reads individuales de shotgun, para caracterizar familias proteicas, el segundo grupo a partir de la anotación funcional de la predicción de genes fue generada por el ensamblado metagenomico, y subsecuentemente agrupados en altos procesos biológicos. La comparación de los resultados del hábitat del intestino generados por el HMP, contra los que genero MetaHit. Mostro que la técnica de aumentar la profundidad del proyecto HMP, es un parámetro importante en caracterizar mejor el contenido génico y la diversidad. Pues se detectó una mayor proporción de anotación y genes nuevos únicos dentro de los protocolos utilizados por el Proyecto de microbioma humano.
En este paper se trata de dar a conocer el microbioma humano a partir de tecnologías de alto rendimiento, en este artículo nos muestran los resultados que se obtuvieron de muestrear diferentes sitios del cuerpo humano de 242 adultos sanos, para generar a partir de la secuencia del rRNA 16S y de WGS información sobre los organismos presentes en el humano, nos muestran los protocolos que siguieron para los análisis, tanto de secuenciación y de ensamblaje, así mismo, se hicieron comparaciones con los datos obtenidos anteriormente en otros proyectos.
Adicionalmente en el artículo se utilizan nuevos protocolos de obtención de muestras, procesamiento y análisis de los datos, los cuales servirán de modelo para estudios posteriores en proyectos similares.
En este artículo describen los recursos del proyecto del microbioma humano que existen a la fecha, la estandarización de los protocolos y controles de calidad que se tienen que usar en los diferentes centros de secuenciación. Desarrollando estos métodos y pasando sus nuevos controles de calidad (quality filtering y trimming de los reads obtenidos) todavía tienen secuencias suficientes para una las siguientes estrategias de análisis, el mapeo genómico, ensamblaje, asignamiento de función de los genes identificados y reconstrucción metabólica. Esta combinación de estrategias permite un análisis exhaustivo y completo de los datos disponibles y obtención máxima de información.
La meta del proyecto es generar una fuente de datos disponibles a toda la comunidad científica para contribuir al estudio del microbioma humano. Hasta ahora, concluyen, existe una colección de 11,174 muestras biológicas que representan al microbioma y las muestras de sangre correspondientes a los donadores, que se almacenan para ser secuenciadas en el futuro y usadas para establecer líneas celulares. Los métodos desarrollados descritos en el artículo incluyen métodos de reclutamiento de donadores, secuenciación y análisis; y los datos que se obtienen a través de estos pueden usarse o sólo en un contexto clínico sino también en estudios comparativos, identificación de nuevas especies, cambios en la composición de las comunidades, entre otros.
Cuando la información acerca de un tema crece tanto como en el caso de la metagenómica, es indispensable contar con referencias exactas de ésta. Este artículo es, me parece, el artículo donde los mayores encargados del proyecto del microbioma se ponen de acuerdo para estandarizar la información, en cinco rubros: muestras, genomas de referencia, protocolos de anotación y métodos y análisis. Para esto se tomaron muestras de 18 o 15 partes del cuerpo de mujeres y hombres, respectivamente, siguiendo un protocolo cuidadoso de selección de individuos, aunque me parece raro que no relacionan estas muestras con metadatos de los individuos, como quizá, perfil racial y ubicación geográfica (puesto que en el artículo del microbioma vaginal se menciona una diferencia quizá atribuible a esto, me parece que podría ser relevante). Puesto que este es un análisis más exhaustivo, se usó amplificación de 16S pero también de todo el genoma mediante shotgun-sequencing. Se generaron 5177 muestras con datos de 16S y WGS y 681 muestras WGS para lugares del cuerpo como cavidades respiratorias, piel, boca, intestino y vagina. A continuación se describe la adopción de un criterio de estandarización del método de pirosecuenciación para evitar los artefactos. Me llama la atención que hayan descubierto que tenían que adoptar un protocolo más estricto, esto nos habla sobre lo fácil que es generar secuencias artificiales. De nuevo y como en todos los estudios del microbioma, el paso del filtrado de sacar las secuencias pertenecientes al humano es importante; en este caso, el 49% de las secuencias son del sujeto y no de bacterias. El que las muestras de tejido blando tengan más contaminación me parece lógico pensando en que hay más desprendimiento de células como elementos inmunes móviles en estos sitios. Para saber de que eran las secuencias generadas por WSG, se comparó con una base de datos de referencia muchos genomas bacterianos, virales y algunos de eucariontes y arqueas. Entre las cosas que se revelan con este estudio, que a fin de cuentas es una especie de control amplio para los estudios del microbioma humano, es que la tecnología de secuenciación que uno escoja debe estar en función de la proporción de secuencias del hospedero que queramos obtener y también en función del grupo de bacteria dominante en cada parte del cuerpo, lo que afecta la amplificación de 16S. Asmimismo, comparando con la base de datos de metaHIT (el proyecto del microbioma pero en Europa), se dieron cuenta de que ellos encontraron menos secuencias redundantes, con lo cual lo ponen como evidencia de que una cobertura amplia es importante para distinguir nuevos grupos.
Este articulo es una muestra del esfuerzo masivo que se esta haciendo para conocer el microbioma humano, con la intensión de obtener beneficios a futuro en el área de la salud humana. Cuatro centros de investigación se encargan de generar la información compuesta por secuencias de 16S, genomas completos y metagenomas de comunidades completas, esto en diferentes regiones del cuerpo humano. Los generados se guardan en el Data Analysis and Coordination Center (DACC) una base de datos que cuenta con accesos a varios software de análisis y protocolos. El articulo habla sobre las estrategias diseñadas y adoptadas por los diferentes grupos para el análisis de la información; por ejemplo se recomienda utilizar la tecnología de secuenciación 454 para la obtención de secuencias de 16S.
Los comentarios están cerrados.